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文献解读 | 邹卫国组鉴定肌腱前体细胞新亚型并成功建立异位骨化模型

 

导读

肌腱异位骨化是肌腱病的一种表现形式,指的是肌腱形成异位骨的病理过程。炎症,受力,基因突变,衰老均可导致肌腱的异位骨化。该疾病主要损害患者的运动功能,造成我国著名的运动员“飞人”刘翔跨栏成绩下滑的原因就是肌腱异位骨化,且目前没有有效的防治措施,主要以手术去除为主。肌腱容易发生异位骨化是由于含有干/前体细胞。鉴定肌腱前体细胞和明确导致其异位骨化的信号通路对于该病的防治具有重要意义。

11月3日,中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)邹卫国研究组在国际学术期刊Journal of Clinical Investigation在线发表题为 “Tendon-derived cathepsin K-expressing progenitor cells activate Hedgehog signaling to drive heterotopic ossification”的研究成果。该研究发现组织蛋白酶K (cathepsin K, Ctsk)可以标记一群肌腱前体细胞,并且在该群细胞中特异性激活Hedgehog signaling可以引起自发性和渐进性肌腱异位骨化。

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为了探究Hh的激活对于Ctsk阳性细胞的影响,将Sufufl / fl小鼠与在内源性Ctsk启动子控制下表达Cre的小鼠杂交(图1,A)。Ctsk-Cre; Sufufl /+小鼠(此后称为Ctsk-Ctrl)显示出正常的骨骼特征(图1,B)。从4周开始,Ctsk-Cre; Sufufl/fl(此后称为Ctsk-CKO)小鼠开始出现行动不便的问题。4周,9周和20周龄Ctsk-CKO小鼠后肢的X射线/μ-CT射线照片显示了自发性和进行性关节周围韧带和肌腱骨化(图1,C)。通过μ-CT分析在20周龄Ctsk-CKO小鼠的后肢跟腱中检测到异位骨化(图1,D)。此外,在40周大的Ctsk-CKO小鼠的肱骨周发现了异位骨。

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图1

 

为了确定Ctsk-CKO小鼠中异位骨化的细胞是来自Ctsk-Cre阳性细胞,交配产生Ctsk-Ctrl; Rosa26-Ai9和Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9小鼠。与Ctsk-Ctrl; Rosa26-Ai9小鼠相比,发现来自6周龄Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9小鼠的跟腱的Ctsk+细胞中的软骨形成标志物-II型胶原蛋白(COLII)和成骨标志物-骨桥蛋白(OPN)的表达水平增加。通过荧光激活细胞分选术(FACS)在Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9跟腱中分离了Ctsk+细胞,发现其分选的Ctsk+细胞中Sufu的表达明显低于对照组Ctsk-Ctrl; Rosa26 Ai9小鼠。并且Ctsk-CKO中Hh靶基因Gli1和Ptch1的表达水平显著上调。Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9小鼠中的Ctsk+细胞显示出上调的软骨生成标志物(Sox9,Col2a1,Aggrecan)和成骨标志物(Alp,Ocn,Opn)。

此外,Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9跟腱的Ctsk +细胞显示与肌腱相关的基因Scx,Mkx和Tnmd的表达下调。重要的是,对4、5和6周龄Ctsk-CKO的COLII和OPN免疫染色表明:HO起始于肌腱中部。Ctsk-CKO中COLII +细胞呈现典型的连续的肌腱细胞的排列,这一事实表明肌腱细胞发生了细胞命运的内在变化。为了进一步证实,交配Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9小鼠与ScxGFP小鼠。发现Ctsk+ScxGFP+细胞表达软骨细胞标志物Aggrecan(图2)。这说明Ctsk+ScxGFP+肌腱细胞向软骨细胞进行分化。

 

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图2

以上数据提示Ctsk+ScxGFP+细胞可能标记一群前体细胞。使用Ai9报告基因小鼠进行了谱系追踪研究,构建了Ctsk-Cre;Rosa26-Ai9小鼠,以红色荧光标记所有Ctsk谱系细胞。肌腱细胞表达Scleraxis(Scx),将Ctsk-Cre;Rosa26-Ai9小鼠与ScxGFP小鼠(表达Scx的细胞带绿色荧光)杂交获得Ctsk-Cre;Rosa26-Ai9; ScxGFP小鼠,发现部分Ctsk-Cre阳性细胞表达Scx(图3, A)。然后,通过FACS分析确定四个不同的细胞亚群:Ctsk-Scx-(84.9%±14.3%),Ctsk-Scx+(2.1%±1%),Ctsk+ Scx-(10.2±1.6%)和Ctsk+ Scx+(2.9%±1.9%)(图3, B)。

此外,Ctsk+Scx+细胞显示富含肌腱前体细胞标志物CD44,CD105,Nestin和Sca1,以及其它已知的干/前体细胞表面标志物,如CD24和CD200(图3, C)。体外形成集落被认为是前体细胞特征之一。为了分析四个细胞亚群的集落形成能力,分离并培养Ctsk-Scx-,Ctsk+Scx-,Ctsk-Scx+和Ctsk+Scx+四群细胞。到培养第7天时,Ctsk+Scx+细胞显示出比其它细胞高得多的集落形成效率(图3, D和E)。结果发现TGFβ配体3(TGFβ3)可以在体外培养Ctsk+Scx+细胞中维持Scx的表达(图3, F)。

接下来,比较四个细胞亚群在成骨,成脂肪和成软骨方面的多能分化潜能。Ctsk-Scx-或Ctsk-Scx+细胞均未在体外显示多能分化潜能。Ctsk+Scx+肌腱来源的细胞显示出比Ctsk+Scx-肌腱来源的细胞更高的分化为所有三个谱系的能力(图3, G)。综上所述,这些数据表明Ctsk+Scx+细胞是肌腱前体细胞。

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图3

 

敲除Hedgehog signaling的下游Gli1/2可以抑制该小鼠模型的异位骨化形成。该研究还发现利用Hedgehog signaling抑制剂JQ1可以在体内外减缓该模型的异位骨化形成(图4)。有意思的是,临床上报道了关于Hedgehog signaling上调引起的肌腱异位骨化病例,该研究为临床提供了潜在治疗靶标。

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图4

 

分子细胞卓越中心邹卫国研究员为本文通讯作者,邹卫国研究组博士生冯恒、邢文辉和韩玉娇博士为本文共同第一作者。该研究得到了分子细胞卓越中心赵允研究员,浙江大学医学院茵梓副教授,陈晓教授和欧阳宏伟教授,浙江省人民医院毕擎主任,上海交通大学医学院的唐玉杰教授的大力支持。经费支持来自中国科学院、国家自然科学基金委、国家科技部、国家杰出科学基金等。该研究得到分子细胞卓越中心公共技术服务中心动物实验技术平台、细胞分析技术平台和分子生物学技术平台的大力支持。

基本信息

题目:Tendon-derived cathepsin K-expressing progenitor cells activate Hedgehog signaling to drive heterotopic ossification
期刊:Journal of Clinical Investigation
影响因子:11.8
客户单位:
中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)
文章作者:博士研究生冯恒、邢文晖和韩玉娇博士
通讯作者:邹卫国 研究员
ABclonal产品:A6889

 

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