为了探究Hh的激活对于Ctsk阳性细胞的影响，将Sufufl / fl小鼠与在内源性Ctsk启动子控制下表达Cre的小鼠杂交（图1，A）。Ctsk-Cre; Sufufl /+小鼠（此后称为Ctsk-Ctrl）显示出正常的骨骼特征（图1，B）。从4周开始，Ctsk-Cre; Sufufl/fl（此后称为Ctsk-CKO）小鼠开始出现行动不便的问题。4周，9周和20周龄Ctsk-CKO小鼠后肢的X射线/μ-CT射线照片显示了自发性和进行性关节周围韧带和肌腱骨化（图1，C）。通过μ-CT分析在20周龄Ctsk-CKO小鼠的后肢跟腱中检测到异位骨化（图1，D）。此外，在40周大的Ctsk-CKO小鼠的肱骨周发现了异位骨。

图1

 

为了确定Ctsk-CKO小鼠中异位骨化的细胞是来自Ctsk-Cre阳性细胞，交配产生Ctsk-Ctrl; Rosa26-Ai9和Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9小鼠。与Ctsk-Ctrl; Rosa26-Ai9小鼠相比，发现来自6周龄Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9小鼠的跟腱的Ctsk+细胞中的软骨形成标志物-II型胶原蛋白（COLII）和成骨标志物-骨桥蛋白（OPN）的表达水平增加。通过荧光激活细胞分选术（FACS）在Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9跟腱中分离了Ctsk+细胞，发现其分选的Ctsk+细胞中Sufu的表达明显低于对照组Ctsk-Ctrl; Rosa26 Ai9小鼠。并且Ctsk-CKO中Hh靶基因Gli1和Ptch1的表达水平显著上调。Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9小鼠中的Ctsk+细胞显示出上调的软骨生成标志物（Sox9，Col2a1，Aggrecan）和成骨标志物（Alp，Ocn，Opn）。

此外，Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9跟腱的Ctsk +细胞显示与肌腱相关的基因Scx，Mkx和Tnmd的表达下调。重要的是，对4、5和6周龄Ctsk-CKO的COLII和OPN免疫染色表明：HO起始于肌腱中部。Ctsk-CKO中COLII +细胞呈现典型的连续的肌腱细胞的排列，这一事实表明肌腱细胞发生了细胞命运的内在变化。为了进一步证实，交配Ctsk-CKO; Rosa26-Ai9小鼠与ScxGFP小鼠。发现Ctsk+ScxGFP+细胞表达软骨细胞标志物Aggrecan（图2）。这说明Ctsk+ScxGFP+肌腱细胞向软骨细胞进行分化。

 

图2

以上数据提示Ctsk+ScxGFP+细胞可能标记一群前体细胞。使用Ai9报告基因小鼠进行了谱系追踪研究，构建了Ctsk-Cre；Rosa26-Ai9小鼠，以红色荧光标记所有Ctsk谱系细胞。肌腱细胞表达Scleraxis（Scx），将Ctsk-Cre；Rosa26-Ai9小鼠与ScxGFP小鼠（表达Scx的细胞带绿色荧光）杂交获得Ctsk-Cre；Rosa26-Ai9; ScxGFP小鼠，发现部分Ctsk-Cre阳性细胞表达Scx（图3, A）。然后，通过FACS分析确定四个不同的细胞亚群：Ctsk-Scx-（84.9％±14.3％），Ctsk-Scx+（2.1％±1％），Ctsk+ Scx-（10.2±1.6％）和Ctsk+ Scx+（2.9％±1.9％）（图3, B）。

此外，Ctsk+Scx+细胞显示富含肌腱前体细胞标志物CD44，CD105，Nestin和Sca1，以及其它已知的干/前体细胞表面标志物，如CD24和CD200（图3, C）。体外形成集落被认为是前体细胞特征之一。为了分析四个细胞亚群的集落形成能力，分离并培养Ctsk-Scx-，Ctsk+Scx-，Ctsk-Scx+和Ctsk+Scx+四群细胞。到培养第7天时，Ctsk+Scx+细胞显示出比其它细胞高得多的集落形成效率（图3, D和E）。结果发现TGFβ配体3（TGFβ3）可以在体外培养Ctsk+Scx+细胞中维持Scx的表达（图3, F）。

接下来，比较四个细胞亚群在成骨，成脂肪和成软骨方面的多能分化潜能。Ctsk-Scx-或Ctsk-Scx+细胞均未在体外显示多能分化潜能。Ctsk+Scx+肌腱来源的细胞显示出比Ctsk+Scx-肌腱来源的细胞更高的分化为所有三个谱系的能力（图3, G）。综上所述，这些数据表明Ctsk+Scx+细胞是肌腱前体细胞。

图3

 

敲除Hedgehog signaling的下游Gli1/2可以抑制该小鼠模型的异位骨化形成。该研究还发现利用Hedgehog signaling抑制剂JQ1可以在体内外减缓该模型的异位骨化形成（图4）。有意思的是，临床上报道了关于Hedgehog signaling上调引起的肌腱异位骨化病例，该研究为临床提供了潜在治疗靶标。

图4

 

分子细胞卓越中心邹卫国研究员为本文通讯作者，邹卫国研究组博士生冯恒、邢文辉和韩玉娇博士为本文共同第一作者。该研究得到了分子细胞卓越中心赵允研究员，浙江大学医学院茵梓副教授，陈晓教授和欧阳宏伟教授，浙江省人民医院毕擎主任，上海交通大学医学院的唐玉杰教授的大力支持。经费支持来自中国科学院、国家自然科学基金委、国家科技部、国家杰出科学基金等。该研究得到分子细胞卓越中心公共技术服务中心动物实验技术平台、细胞分析技术平台和分子生物学技术平台的大力支持。