孙军等研究人员首先构建Prx1-Cre间充质干细胞中缺乏组蛋白去甲基化酶LSD1的条件性敲除小鼠（Prx1-Cre; Lsd1 fl / fl小鼠），发现其骨折愈合受损。进一步组织学分析发现其软骨内成骨过程（软骨痂形成）发生障碍（图1）。

图1

 

使用Rosa26-Ai9报告小鼠进行谱系示踪研究，其中Cre表达细胞及其后代表达tdTomato荧光。为确定Prx1-Cre标记的细胞迁移和增殖是否受损，进一步观察了Lsd1Prx1; Ai9（Prx1-Cre; Lsd1fl/fl; Rosa26-Ai9）小鼠和Prx1-Ctrl; Ai9（Prx1-Cre; Lsd1fl/+; Rosa26-Ai9）小鼠的1 dpf, 2 dpf, 3 dpf, 4.5 dpf和7 dpf的骨折部位，来追踪Prx1谱系细胞。

结果显示，在1 dpf时，Prx1谱系骨膜细胞并无明显变化，但在2 dpf时，Prx1谱系骨膜细胞在Prx1-Ctrl; Ai9小鼠和Lsd1Prx1; Ai9小鼠发生骨膜反应，开始扩增聚集。在3 dpf时，Prx1-Ctrl; Ai9小鼠和Lsd1Prx1; Ai9小鼠的Prx1谱系骨膜细胞明显增厚，在4.5 dpf时，骨折断处聚集了大量的Prx1谱系细胞，表明LSD1的缺失可能不影响Prx1谱系细胞在损伤部位的招募。但是在7 dpf，Prx1-Ctrl; Ai9小鼠的骨痂已出现明显的软骨，而Lsd1Prx1; Ai9小鼠还未观察到明显的软骨

图2

 

由于骨折后4.5天骨痂中的MSC处于即将分化成软骨的阶段，为了探索在Lsd1Prx1; Ai9中软骨生成障碍的机制，研究人员在骨折后4.5天从Lsd1Prx1; Ai9小鼠和Prx1-Ctrl; Ai9小鼠骨痂中分选出Prx1阳性（tdTomato阳性）细胞进行RNA-seq。送测序前首先鉴定了Lsd1Prx1; Ai9小鼠4.5 dpf骨痂LSD1的敲除效率，发现LSD1蛋白明显被敲除。通过比较来自Lsd1Prx1小鼠和Prx1-Ctrl小鼠的样品的转录组，发现软骨细胞主调节因子Sox9的表达在Lsd1Prx1小鼠的骨痂细胞中明显下调，并且其它软骨标志物Col2a1和Col10a1等大大下调（图3）。

图3

 

由于骨折后4.5天骨痂中的MSC处于即将分化成软骨的阶段，为了探索在Lsd1Prx1; Ai9中软骨生成障碍的机制，研究人员在骨折后4.5天从Lsd1Prx1; Ai9小鼠和Prx1-Ctrl; Ai9小鼠骨痂中分选出Prx1阳性（tdTomato阳性）细胞进行RNA-seq。送测序前首先鉴定了Lsd1Prx1; Ai9小鼠4.5 dpf骨痂LSD1的敲除效率，发现LSD1蛋白明显被敲除。通过比较来自Lsd1Prx1小鼠和Prx1-Ctrl小鼠的样品的转录组，发现软骨细胞主调节因子Sox9的表达在Lsd1Prx1小鼠的骨痂细胞中明显下调，并且其它软骨标志物Col2a1和Col10a1等大大下调（图3）。

图4

 

研究人员发现维甲酸（RA）信号通路相关基因在Lsd1Prx1的Prx1谱系细胞中富集。这个通路的大多数基因被上调，而Aldh1a2是其中表达上调最多的基因。ALDH1A2是限速酶，其作用是催化视黄醛合成视黄酸（RA）。免疫荧光显示Lsd1Prx1小鼠的骨膜相比于对照小鼠的骨膜表达更多ALDH1A2。再通过酶活检测，视黄酸含量测定等实验，发现Lsd1Prx1的体内的视黄酸信号上调（图5）。

图5

 

通过体外实验发现视黄酸受体（RAR）拮抗剂AGN193109，可以抑制RA信号并缓解了Lsd1Prx1细胞的向软骨分化的缺陷。为了确定AGN193109的体内效果，对Lsd1Prx1小鼠和对照小鼠在2 dpf至12 dpf期间，进行AGN193109（每天4 mg/kg）给药。使用AGN193109后，Lsd1Prx1小鼠在14 dpf时软骨痂形成得到改善。总体而言，这些数据表明RA信号抑制骨折愈合，并导致Lsd1Prx1小鼠骨折修复受损（图6）。

图6

 

文章首次证明了组蛋白修饰酶LSD1是调控骨折修复过程中软骨内成骨的关键因子，为临床上骨折愈合不良的治疗提供启示。

分子细胞卓越中心邹卫国研究员为本文通讯作者，邹卫国研究组的孙军博士（现为康奈尔大学医学院博后）和博士研究生冯恒为本文共同第一作者。经费支持来自中国科学院、国家自然科学基金委、国家科技部、国家杰出科学基金等。该研究得到分子细胞卓越中心公共技术服务中心动物实验技术平台、细胞分析技术平台和分子生物学技术平台的大力支持。