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文献解读 | 邹卫国组发现影响骨折愈合的重要因素

 

导读

骨折(Fracture)指的是骨在遭受暴力后其连续性和结构被破坏。骨具有强大的自愈能力,大多数骨折会慢慢愈合。然而,一部分病人发生骨折后却难以愈合。骨折延迟愈合发生率约为10%-15%。我国发生骨折事件每年超过千万次,所以研究影响骨折愈合的机制对于临床治疗至关重要。

2020 年 11 月 4 日,中国科学院分子细胞卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)的邹卫国研究员为通讯作者(孙军和冯恒为共同第一作者)在 Science Advances 上发表题为 Histone demethylase LSD1 is critical for endochondral ossification during bone fracture healing 的研究。该研究发现组蛋白去甲基化酶LSD1通过调控视黄酸信号通路来影响骨折修复。

《文献解读 | 邹卫国组发现影响骨折愈合的重要因素》

孙军等研究人员首先构建Prx1-Cre间充质干细胞中缺乏组蛋白去甲基化酶LSD1的条件性敲除小鼠(Prx1-Cre; Lsd1 fl / fl小鼠),发现其骨折愈合受损。进一步组织学分析发现其软骨内成骨过程(软骨痂形成)发生障碍(图1)。

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图1

 

使用Rosa26-Ai9报告小鼠进行谱系示踪研究,其中Cre表达细胞及其后代表达tdTomato荧光。为确定Prx1-Cre标记的细胞迁移和增殖是否受损,进一步观察了Lsd1Prx1; Ai9(Prx1-Cre; Lsd1fl/fl; Rosa26-Ai9)小鼠和Prx1-Ctrl; Ai9(Prx1-Cre; Lsd1fl/+; Rosa26-Ai9)小鼠的1 dpf, 2 dpf, 3 dpf, 4.5 dpf和7 dpf的骨折部位,来追踪Prx1谱系细胞。

结果显示,在1 dpf时,Prx1谱系骨膜细胞并无明显变化,但在2 dpf时,Prx1谱系骨膜细胞在Prx1-Ctrl; Ai9小鼠和Lsd1Prx1; Ai9小鼠发生骨膜反应,开始扩增聚集。在3 dpf时,Prx1-Ctrl; Ai9小鼠和Lsd1Prx1; Ai9小鼠的Prx1谱系骨膜细胞明显增厚,在4.5 dpf时,骨折断处聚集了大量的Prx1谱系细胞,表明LSD1的缺失可能不影响Prx1谱系细胞在损伤部位的招募。但是在7 dpf,Prx1-Ctrl; Ai9小鼠的骨痂已出现明显的软骨,而Lsd1Prx1; Ai9小鼠还未观察到明显的软骨

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图2

 

由于骨折后4.5天骨痂中的MSC处于即将分化成软骨的阶段,为了探索在Lsd1Prx1; Ai9中软骨生成障碍的机制,研究人员在骨折后4.5天从Lsd1Prx1; Ai9小鼠和Prx1-Ctrl; Ai9小鼠骨痂中分选出Prx1阳性(tdTomato阳性)细胞进行RNA-seq。送测序前首先鉴定了Lsd1Prx1; Ai9小鼠4.5 dpf骨痂LSD1的敲除效率,发现LSD1蛋白明显被敲除。通过比较来自Lsd1Prx1小鼠和Prx1-Ctrl小鼠的样品的转录组,发现软骨细胞主调节因子Sox9的表达在Lsd1Prx1小鼠的骨痂细胞中明显下调,并且其它软骨标志物Col2a1和Col10a1等大大下调(图3)。

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图3

 

由于骨折后4.5天骨痂中的MSC处于即将分化成软骨的阶段,为了探索在Lsd1Prx1; Ai9中软骨生成障碍的机制,研究人员在骨折后4.5天从Lsd1Prx1; Ai9小鼠和Prx1-Ctrl; Ai9小鼠骨痂中分选出Prx1阳性(tdTomato阳性)细胞进行RNA-seq。送测序前首先鉴定了Lsd1Prx1; Ai9小鼠4.5 dpf骨痂LSD1的敲除效率,发现LSD1蛋白明显被敲除。通过比较来自Lsd1Prx1小鼠和Prx1-Ctrl小鼠的样品的转录组,发现软骨细胞主调节因子Sox9的表达在Lsd1Prx1小鼠的骨痂细胞中明显下调,并且其它软骨标志物Col2a1和Col10a1等大大下调(图3)。

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图4

 

研究人员发现维甲酸(RA)信号通路相关基因在Lsd1Prx1的Prx1谱系细胞中富集。这个通路的大多数基因被上调,而Aldh1a2是其中表达上调最多的基因。ALDH1A2是限速酶,其作用是催化视黄醛合成视黄酸(RA)。免疫荧光显示Lsd1Prx1小鼠的骨膜相比于对照小鼠的骨膜表达更多ALDH1A2。再通过酶活检测,视黄酸含量测定等实验,发现Lsd1Prx1的体内的视黄酸信号上调(图5)。

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图5

 

通过体外实验发现视黄酸受体(RAR)拮抗剂AGN193109,可以抑制RA信号并缓解了Lsd1Prx1细胞的向软骨分化的缺陷。为了确定AGN193109的体内效果,对Lsd1Prx1小鼠和对照小鼠在2 dpf至12 dpf期间,进行AGN193109(每天4 mg/kg)给药。使用AGN193109后,Lsd1Prx1小鼠在14 dpf时软骨痂形成得到改善。总体而言,这些数据表明RA信号抑制骨折愈合,并导致Lsd1Prx1小鼠骨折修复受损(图6)。

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图6

 

文章首次证明了组蛋白修饰酶LSD1是调控骨折修复过程中软骨内成骨的关键因子,为临床上骨折愈合不良的治疗提供启示。

分子细胞卓越中心邹卫国研究员为本文通讯作者,邹卫国研究组的孙军博士(现为康奈尔大学医学院博后)和博士研究生冯恒为本文共同第一作者。经费支持来自中国科学院、国家自然科学基金委、国家科技部、国家杰出科学基金等。该研究得到分子细胞卓越中心公共技术服务中心动物实验技术平台、细胞分析技术平台和分子生物学技术平台的大力支持。

基本信息

题目:Histone demethylase LSD1 is critical for endochondral ossification during bone fracture healing
期刊:Science Advances
影响因子:13.1
客户单位:
中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)
文章作者:孙军博士、博士研究生冯恒
通讯作者:邹卫国 研究员
ABclonal产品:A6889

 

 

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