细胞焦亡，也称为炎性坏死，是程序性细胞死亡的高度炎性形式，最早于2001年由Brad T. Cookson博士发现【1】，其特征是细胞肿胀和质膜上出现大气泡。最近，新出现的证据表明，热解在抑制肿瘤细胞的体外增殖和体内肿瘤的生长中起着至关重要的作用。与其他类型的细胞死亡相比，细胞焦亡具有独特的形态和机制。Caspase-1是一种白介素1转化酶（ICE），通过蛋白水解方式切割炎性细胞因子的前体，例如白介素1β（IL-1β）和IL-18，以及Gasdermin D（GSDMD）。capsase-1可以被多种炎性体募集，并在其组装后在炎性体中被激活。包含NACHT，LRR和PYD域的蛋白质3（NLRP3），也称为NALP3，属于NOD样受体（NLR），还与适配器凋亡相关的斑点样蛋白一起含有CARD（ASC）蛋白PYCARD，一个N端PYRIN-PAAD-DAPIN结构域（PYD）和一个C端caspase补充结构域（CARD），形成caspase-1激活复合物，称为NLRP3炎性体。

越来越多的证据表明，NLRP3炎性小体是最具特征和研究最多的炎性小体，对各种激活剂（例如微生物及其衍生产物）以及内源性危险信号有反应。NLRP3炎性小体的激活需要以下两个不同的信号：第一个是合成核因子κB（NF-κB）介导的NLRP3，以及通过炎症刺激（例如TLR4激动剂）表达IL-1β和IL-18的前体。第二个信号是NLRP3炎性小体，caspase-1活化以及IL-1β和IL-18分泌物的组装。氧化应激的特征是活性氧（ROS）的产生与积累之间的不平衡，活性氧的积累主要来自线粒体的损伤。最新证据表明，ROS作为细胞生理学的第二信使，在控制肿瘤生长和信号转导中起着重要作用。最近，ROS也被认为是NLRP3炎性小体活化的首批鉴定触发因素之一，据报道许多化合物通过增加细胞内ROS水平来激活NLRP3炎性小体。同时，典型的ROS清除剂N-乙酰基和P22（phox）可以显着下调NLRP3炎性体。因此，ROS生成对于NLRP3炎性小体的激活至关重要。此外，ROS在信号转导途径中也起着关键作用。最初认为NF-κB通路可调节炎症小体的活化并改善NLRP3蛋白的表达。同时，许多研究表明N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）可以抑制NF-κB信号通路，从而抑制体内和体外的转录，从而导致促炎性细胞因子的分泌减少 【2】。因此，ROS介导的NF-κB信号通路在NLRP3炎性小体的激活中起重要作用。

迄今为止，已经从天然植物中分离出许多批准的具有有效抗肿瘤作用的药物，例如长春花生物碱，鬼臼毒素，紫杉烷，喜树碱等。中国的传统中药（TCM）已有2000年的历史，并被证明在预防和治疗多种疾病方面是安全有效的。延龄草tschonoskii Maxim（TTM），在中国也被称为燕灵草，是中国常用的民间草药，具有许多药理作用，例如降压，神经保护，抗炎，镇痛和溶血以及抗衰老。此前，吴安国研究组曾报道过TTM中的主要皂苷polyphyllin VI（PPVI）在体内外均能显着抑制NSCLC【3】。该研究于去年9月份发表在Pharmacological research（IF:5.574）上，题目为Polyphyllin VI, a saponin from Trillium tschonoskii Maxim. induces apoptotic and autophagic cell death via the ROS triggered mTOR signaling pathway in non-small cell lung cancer. Pharmacol Res. 2019; 147:104396。本研究是该文章的一个延续，西南医科大学药学院（中药活性筛选与成药性评价重点实验室）吴安国研究组与澳门实验室合作在Cancers杂志上在线发表了题为“Polyphyllin VI Induces Caspase-1-Mediated Pyroptosis via the Induction of ROS/NF-κB/NLRP3/GSDMD Signal Axis in Non-Small Cell Lung Cancer”的文章。

在这项研究中，论文作者首先应用Western blot法发现PPVI处理的肿瘤组织中的焦亡相关的关键蛋白包括NLRP3,ASC,caspase1,GSDMD,IL-1β和IL-18的表达均显著上调，同时免疫组化的结果也进一步证明了PPVI可以显著提高肿瘤组织中NLRP3, caspase1与GSDMD的表达。

图1.PPVI激活裸鼠非小细胞肺癌肿瘤组织中的NRLP3炎性小体

在体外，应用荧光显微镜观察发现，PPVI可以在A549及H1299细胞中显著产生大泡，并最终导致细胞死亡。

图2.荧光动态成像发现PPVI诱导A549发生焦亡

进一步应用流式细胞及MTT法发现casapase1抑制剂可以显著地抑制PPVI诱导的A549及H1299细胞的死亡。同时，应用质粒瞬转法将质粒pCMV-mTOR-Flag 、pcDNA3.1(+)-Flag-AKT1、pcDNA3.1(+)-Flag-MAPK3、EGFP-LC3、EGFP-N1-NLRP3、mCherry-C1-ASC、EGFP-N1-caspase-1转染入细胞中，结果发现，PPVI可以显著提高细胞中相应的荧光表达。

图3. PPVI显著提高了A549及H1299细胞中NLRP3,ASC与caspase-1的荧光表达

在机理研究中，首先应用流式细胞法检测发现PPVI可以显著提高细胞内的活性氧（ROS）水平。应用Western blot法检测发现PPVI可以显著激活NF-kB信号通路，且PPVI诱导的A549与H1299的死亡与ROS/NF-kB信号通路的激活密切相关。最终，得出结论PPVI诱导的NLRP3炎性小体激活与ROS /NF-κB/ NLRP3 / GSDMD信号轴的激活密切相关。

图4. PPVI诱导A549与H1299细胞焦亡的分子机制

因此，本研究首次阐明了PPVI抑制NSCLC的机制，并证明PPVI对于将来进一步开发治疗NSCLC的新候选药物具有重要的价值。

该项研究工作在中药活性筛选与成药性评价重点实验室吴安国副教授的指导下，由实验室研究生滕金凤等同学完成。同时，该研究得到了澳门科技大学黄锦伟，罗婉君教授等大力协助。该项成果受到了国家自然科学基金委、科技厅等经费的支持。该工作的数据收集还得到了西南医科大学心肌电教育部重点实验室，澳门科技大学中药治疗研究国家重点实验室等的支持。

 

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参考文献

1. Cookson, B.T.; Brennan, M.A. Pro-inflammatory programmed cell death. Trends. Microbiol. 2001, 9, 113–114.
2. Zha, L.Y.; Chen, J.D.; Sun, S.X.; Mao, L.M.; Chu, X.W.; Deng, H.; Cai, J.W.; Li, X.F.; Liu, Z.Q.; Cao, W.H. Soyasaponins Can Blunt Inflammation by Inhibiting the Reactive Oxygen Species-Mediated Activation of PI3K/Akt/NF-kB Pathway. PLoS ONE 2014, 9, e107655,.
3. Teng JF, Qin DL, Mei QB, Qiu WQ, Pan R, Xiong R, Zhao Y, Law BYK, Wong VK, Tang Y, Yu CL, Zhang F, Wu JM, Wu AG. Polyphyllin VI, a saponin from Trillium tschonoskii Maxim. induces apoptotic and autophagic cell death via the ROS triggered mTOR signaling pathway in non-small cell lung cancer. Pharmacol Res. 2019; 147:104396