图1：细胞凋亡与细胞坏死比较

 

凋亡通路概述

细胞凋亡是一个异常复杂的级联调控过程，有两个主要的凋亡途径：外源性途径（死亡受体途径）和内源性途径（线粒体途径）。两种途径相互联系、共同调节而最终完成细胞凋亡[5,6]。外源性途径由细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因子受体家族(tumour necrosis factor receptor，TNF-R)引发[7]。参与的配体和相应的死亡受体包括FasL / FasR，TNF-α/ TNFR1，Apo3L / DR3，Apo2L / DR4和Apo2L / DR5 [8-11]。接头蛋白（FADD / TRADD）招募Pro-Caspase-8，导致死亡诱导信号复合体（DISC）的形成，Caspase-8 寡聚化并通过自催化被激活，激活的Caspase-8 进而诱导细胞凋亡[12]。内源性途径由细胞内信号介导，胞内信号响应于不同的应激条件（例如辐射、化疗等）在线粒体水平汇聚[13]。内部刺激如不可修复的遗传损伤、缺氧、胞浆Ca2+浓度极高以及严重的氧化应激，都是内在线粒体途径启动的触发因素[14]。随后激活的Bcl-2家族促凋亡成员-仅含BH3结构域蛋白（例如Bax、Bak）中和抗凋亡蛋白（例如Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1），使得线粒体外膜通透化（MOMP），导致细胞色素C 释放[15]。细胞色素C结合并激活Apaf-1和pro-Caspase-9，形成“凋亡小体” [16]。该过程依次激活下游效应蛋白Caspases-3，Caspases-6和Caspases-7，降解相应底物导致细胞凋亡[17,18]。信号通路图如下（图2）：

图2：凋亡信号通路

 

细胞凋亡检测解决方案

➤ 1、细胞凋亡过程中，经常会用到一些KO细胞模型，ABclonal为了方便大家进行机制研究，提供凋亡核心靶点KO细胞模型产品（图4），同时ABclonal也可提供CRISPR/Cas9基因敲除服务。

图3：凋亡核心靶点KO细胞模型（节选）

 

➤ 2、细胞凋亡常见检测方法

细胞凋亡与其他细胞死亡是完全不同的死亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以区别开来。

细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。

 

方法一：mRNA水平的检测

科学家们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和Bcl-xL作为抗凋亡的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。因而可以用qPCR技术（➤详情请点击往期推文：新款通用型qPCR mix，专治各种不服 & 新品上市–Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix & 新品发布：ABScriptⅡ One Step RT-qPCR Probe Kit）来检测Fas, Bax 和 Bcl-xL基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

 

方法二： 凋亡核心分子检测

通常以Western Blot检测凋亡通路明星蛋白，如Caspase家族蛋白Caspase-8、Caspase-6和Caspase-3的前体和剪接体，以及Caspase -3的底物PARP分子；又如Bcl-2家族蛋白，抑制凋亡的Bcl-2和促进凋亡的Bax，在以Western Blot检测Bcl-2和Bax的表达量后，通过Bcl-2/Bax的比值，可表征细胞凋亡的程度；细胞色素C（Cytochrome C）作为一种信号物质，正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合Apaf-1（Apoptotic protease activating factor-1）后启动Caspase级联反应，因而可以通过组化或荧光方法检测Cytochrome C定位来判断细胞凋亡。

 

案例展示

图4：案例展示

 

其他凋亡检测方法

方法三：流式细胞术检测（FCM, Annexin V-PI双染色实验）

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布于细胞膜磷脂双分子层内侧，细胞处于凋亡早期时，PS发生外翻出现在细胞外侧，Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，可与PS高度亲和，因而Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡晚期和死细胞中，PI可透过细胞膜与细胞核结合。Annexin V和PI配合使用，可以将凋亡早期细胞和晚期细胞以及死细胞区分开来。需要注意的是随着研究的发展，Annexin V-PI双染色实验已经不能完全作为凋亡的一个独立判定标准，可先作为凋亡初期预测，需要配合其他检测方法一起判定是否不可逆的发生了细胞凋亡。

Annexin V-PI双染实验可将细胞分为四种类型（图5）

图5：Annexin V-PI双染色实验

 

B4象限：Annexin V阳性且PI阴性，为早期凋亡细胞；

B3象限：Annexin V阴性且PI阴性（双阴性细胞），为活细胞；

B2象限：Annexin V阳性且PI阳性（双阳性细胞），为晚期凋亡细胞；

B1象限：Annexin V阴性且PI阳性，为坏死细胞。

 

方法四：核酸电泳检测（DNA片段检测法）

细胞凋亡时DNA会发生片段化，形成200bp的整数倍；而细胞坏死时DNA发生无规则断裂。因而在凝胶电泳中，如果出现这种显著特征的电泳条带，就可以判断细胞发生了凋亡（图6）。

图6：DNA片段凝胶电泳

 

方法五：TUNEL分析凋亡相关DNA损伤

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3′-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3′-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3′-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

 

常见凋亡抑制剂和激活剂

图7：常见凋亡抑制剂和激活剂

 

参考文献

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