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抗体在植物研究中的应用

 

背景

抗体是研究蛋白的重要工具,能够帮助研究者检测、追踪,分离纯化细胞中的目的蛋白,因此抗体在生命科学研究中具有广泛的应用。但是,相比于其它学科,植物领域对抗体使用的相对较少,一方面是市场上缺少商品化的植物抗体,另外一方面,植物领域的研究者还没有形成使用抗体的习惯,文献中使用抗体进行研究的案例较少。

 

最近万建民院士在Plant cell上发表的一篇文章:GPA5 Encodes a Rab5a Effector Required for Post-Golgi Trafficking of Rice Storage Proteins,解析了水稻谷蛋白的后高尔基体分选机制,文章中对抗体进行大量的使用,涉及到很多很好的实验技术和研究思路,非常具有借鉴价值,我们现在就为大家盘点一下文章中一些比较有代表性的抗体应用技术:

 

1、用Western Blot(WB)筛选突变体

突变体是重要的研究材料,筛选鉴定突变体通常都是通过表型观察的方法,但是有时候也需要借助分子和生化手段。比如谷蛋白57H是57 Kd谷蛋白前体增加、成熟酸碱亚基含量减少的一类种质资源,是解析谷蛋白合成、分选以及沉积的理想遗传材料。筛选57H材料的一个重要方法是用western blot(WB)检测水稻籽粒中57 Kd谷蛋白前体以及成熟酸碱亚基的含量,这里需要用到两个抗体,一个是识别谷蛋白酸性亚基的抗体,一个是识别碱性亚基的抗体,当然,这两个抗体也都能够识别谷蛋白前体,因为谷蛋白的酸性和碱性亚基都是谷蛋白前体的一部分。图1是文章中展示的WB检测的结果,gpa5突变体中57 Kd的谷蛋白前体相对于野生型明显增加,而成熟的酸性和碱性亚基的含量则明显减少,这说明gpa5突变体是典型的57H材料,具有重要的研究价值。

《抗体在植物研究中的应用》

图1:gpa5突变体中谷蛋白前体以及成熟酸性碱性亚基的含量gpa5突变体中57 Kd的谷蛋白前体(箭头)相对于野生型明显增加,而成熟的酸性(黑三角)和碱性(红三角)亚基的含量则明显减少

 

2、用免疫荧光技术研究蛋白在细胞中的分布

免疫荧光是常用的细胞定位技术,能够反映蛋白在native的状态下的细胞定位情况。在这篇文章中,作者用双重免疫荧光技术同时观察了gpa5突变体和野生型胚乳细胞中谷蛋白(Glutelin)和球蛋白(Globulin)的分布。作者用绿色的二抗标记球蛋白,红色的二抗标记谷蛋白,用蓝色的染料标记细胞壁。结果如图2所示,野生型水稻胚乳细胞中的谷蛋白(Glutelin)和球蛋白(Globulin)都储存在蛋白体II中,且球蛋白主要储存在蛋白体II的外围;而gpa5突变体中,谷蛋白和球蛋白都很不正常的储存在靠近细胞壁(Cell wall,CW)的拟壁体(paramural bodies, PMBs)中。这各实验结果非常直观的说明了gpa5突变体中谷蛋白和球蛋白被错误的分选。

《抗体在植物研究中的应用》

图2:野生型和gpa5中GLutelin和Globulin的双重免疫荧光实验绿色的表示Globulin,红色的表示GLutelin,蓝色表示细胞壁

 

3、免疫胶体金实验对蛋白进行亚细胞定位

用Confocal观察荧光蛋白(如GFP、CFP、RFP等)标记的目的蛋白是蛋白亚细胞定位的常用方法,但是这种方法也经常会遇到分辨率差的问题,特别是一些小的细胞器很难观察到。但是免疫胶体金标记结合透射电子显微镜技术能够非常清晰的观察到目的蛋白在各种细胞器上的定位。在这篇文章中,作者用双重免疫胶体金技术,分别用5 nm的金粒和15 nm的金粒标记了GAP5蛋白和谷蛋白,进而通过透射电子显微镜同时观察到了这两个蛋白的细胞器定位情况。结果如图3所示,GAP5(红色箭头)主要分布在原理高尔基体(G)的致密囊泡表面,而谷蛋白主要分布在致密囊泡和蛋白体II (PBII)内。

《抗体在植物研究中的应用》

图3:双重免疫胶体金技术显示GPA5和谷蛋白的亚细胞定位G表示高尔基体,PBII表示蛋白体II,红色箭头所指的球星细胞器表示致密囊泡,红色箭头和直径较小的黑色圆点(5 nm)表示GPA5蛋白,直径较大的圆点(15 nm)表示谷蛋白

 

4、CoIP研究GAP5的互作蛋白

研究蛋白互作具有多种方法,但是免疫共沉淀技术(CoIP)是研究蛋白互作的金标准,能反映细胞内的真实互作,而且CoIP不仅可以通过Western Blot(CoIP-WB)验证已知的蛋白互作,还能结合质谱分析的方法(CoIP-MS)鉴定未知的蛋白互作。这篇文章中,作者用CoIP-MS,发现GPA5能和GAP1以及铨系复合物(CORVET Complex和SNARE Complex)的各亚基互作(图4),并通过CoIP-WB进一步证实了互作的真实性,从而揭示了GAP5的工作模型。

《抗体在植物研究中的应用》

图4:CoIP-MS及CoIP-WB证实了GAP5能和铨系复合物CORVET Complex和SNARE Complex各亚基互作

除了上述实验结果之外,这篇文章中还有大量的其它抗体参与的实验数据来全方位支持文章的结论。对于植物领域的研究,这篇文章中所用到的实验方法和研究思路具有非常高的借鉴价值,希望看到本篇文章的科研工作者能够结合自己的课题进行使用,也许会在对某些问题的研究上有更多的启发。

 

 

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