一种全新的细胞死亡形式——铁死亡

2019年12月24日 | 评论0 | 阅读21,615 | 点赞12

背景介绍

铁代谢与铁死亡

铁是维持生物体生命的重要微量元素，在人体氧化代谢、细胞生长与增殖、氧的运输和储存中均有重要作用。在参加三羧酸循环的酶和辅酶中，约半数含有铁或者需要铁辅助。铁的代谢过程在包括人在内的高级动物中有完善的控制体系，保持铁在内环境的稳态平衡。许多疾病可以导致铁代谢紊乱，铁代谢紊乱也可引起多种疾病，例如铁缺乏可导致贫血、智力发育迟缓等多种疾病，铁过量则可促使产生大量自由基，引起神经变性性疾病及许多与老年相关的疾病。近年来研究发现铁代谢与一种新的细胞死亡形式—铁死亡（Ferroptosis）有关。

图1：铁过量和铁缺乏对细胞的损害。Alexander R. Bogdan, TiBS, 2015

铁死亡最早是2012年由哥伦比亚大学Brent R. Stockwell提出的。此前的研究发现Erastin可以特异性诱导Ras突变细胞死亡，但对其作用机制认识还不清楚。Erastin处理后的细胞没有典型的细胞凋亡特征，Brent R. Stockwell团队发现铁螯合剂可以抑制这一过程，并且另一种化合物RSL3也有类似的细胞死亡表型。2012年，Brent R. Stockwell团队正式将该细胞死亡形式命名为铁死亡。铁死亡与肿瘤抑制、神经元退化、中风、脑出血、脑外伤、抗病毒免疫反应和器官缺血-再灌注损伤及肾衰竭等多种生理和病理过程有关，通过激活或抑制铁死亡可以干预疾病的发展，因而成为近年来新的研究热点。

图2：哥伦比亚大学Brent R. Stockwell首次提出铁死亡。Scott J. Dixon,Cell,2012

目前与铁死亡相关的主要信号作用分子已经明确，对它的形态学、生物学、机制通路等有了部分了解，但铁死亡过程涉及多种机制，受到信号通路的精密调控，铁死亡与疾病的发生有何种联系，是否与其他细胞死亡方式联合介导疾病的进展，因此，进一步深入研究铁死亡的作用机理，研究其在不同疾病类型中的作用，对寻找相关疾病的治疗靶点、靶向药物的研发具有重要意义。从历年国家自然科学基金中标项目分析我们发现，2013年河北医科大学申请第一项关于“铁死亡”的项目，随后2014年2项，2016年3项，从2017年突然增加到16项，2018年急剧增加到44项，2019年几乎倍增至76项，累计资助经费6008.2万，都说明了铁死亡研究不断受到科学家的重视，成为了新的研究“宠儿”。

图3：关键词“铁死亡”检索国自然科学基金（未包括关键词“Ferroptosis”）

1、铁死亡特征

铁死亡的实质是由于膜脂修复酶—谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)失效，细胞内脂质氧化物代谢障碍，在铁离子催化作用下，造成膜脂上活性氧自由基(ROS)堆积，使细胞内氧化还原失衡，诱导细胞死亡，释放前炎症介质(如HMGB1等)。GPX4酶受到抑制（如RSL3）也可以直接导致这一作用，而铁离子螯合剂则可以抑制这一过程。

铁死亡在细胞形态学、生化特征以及基因水平上都与凋亡、自噬、坏死等传统的细胞死亡方式具有显著的差异，具体表现为：

>>>>1、细胞形态变化

超微形态学特征显示细胞膜断裂和出泡，线粒体变小、膜密度增高、线粒体脊减少或消失、线粒体外膜断裂，细胞核大小正常、但缺乏染色质凝聚。电镜下表现为细胞内线粒体变小及双层膜密度增高。

图4：铁死亡细胞形态学特征。Lewerenz J,G Ates,FrontNeurosci,2018.

>>>>2、生化特征变化：

铁和活性氧(ROS)聚集，激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)系统，降低胱氨酸的摄取、耗尽胞内谷胱甘肽（GSH），抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白system Xc- （由两个亚基组成，轻链亚基SLC7A11（也称为xCT）和重链亚基SLC3A2（也称为CD98））和增加NADPH氧化酶（NOXs），释放花生四烯酸（arachidonic acid;ARA）等介质。

>>>>3、基因水平变化：

铁死亡受细胞内信号通路的严密调节，包括铁稳态的调节通路，RAS/Raf/MAPK通路以及胱氨酸转运通路。细胞内Cox2, ACSL4, NOX1, GPX4, SLC7A11, Ferritin和Ferritin Light Chain等相关因子发生变化，其中Cox2, ACSL4和NOX1在铁死亡细胞中表达上调; GPX4, SLC7A11, Ferritin和Ferritin Light Chain在铁死亡细胞中表达下调。

图5：铁死亡分子机制及相关信号通路调控。Y Xie, Cell Death and Differentiation,2016

>>>>4、免疫学特征：

损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)释放前炎症介质(如HMGB1等)。

2、铁死亡研究进展

>>>>1、铁死亡与肿瘤

铁死亡在有关肿瘤的研究中成为近几年的热点之一。癌细胞容易受到硫醇代谢的干扰，而过量铁的氧化应激与致癌作用有关。通过抑制system Xc-抑制胱氨酸摄取的药物，如柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine），可阻止肿瘤的生长并在某些情况下诱发铁死亡。同样，使用工程改造的胱氨酸降解酶偶联物（cyst（e）inase）从血浆中直接去除胱氨酸可阻止肿瘤生长并触发细胞死亡。SLC7A11在多种类型的人类癌症中高表达，并与患者生存率负相关，高表达的SLC7A11通过促进胱氨酸的摄取，合成还原性GSH保护癌细胞免受氧化应激和铁中毒，越来越多的证据表明SLC7A11是一种潜在的肿瘤生物标志物。提高erastin衍生物的溶解度、分离度以及效价，其中的某些衍生物在异种移植肿瘤中已经初见成效。纳米颗粒诱导铁死亡也在异种移植研究中得到了证实。2019年5月2日，密歇根大学邹伟平教授团队在Nature上发表文章CD8+ T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy，首次揭示CD8+T细胞可以通过IFNγ调控肿瘤细胞的铁死亡过程。因此，越来越多的证据表明铁死亡可作为肿瘤抑制新靶点。

>>>>2、铁死亡与神经系统疾病

研究证实铁死亡抑制剂（ferrostatins 和liproxstatins等）在包括帕金森氏症（PD），亨廷顿氏症（HD）和阿尔茨海默症（AD）在内的退化性脑疾病模型中，以及在其他形式的神经退行性疾病，创伤性和出血性脑损伤中具有保护作用，同时在小鼠模型中也能保护肝，肾和心脏免受缺血性损伤。在 GPX4 选择性敲除后建立的小鼠模型中，小鼠迅速出现麻痹状态，并在 8 周内死去，补充了维生素 E(铁死亡抑制剂)的对照组，小鼠麻痹和死亡时间均推迟。对其病理学检查发现小鼠脊髓的运动神经元发生严重退化。从而证实，GPX4 在运动神经元中的重要作用。在PD中，凋亡、自噬、坏死、铁死亡等多种细胞死亡方式均参与多巴胺能神经元的变性死亡。

>>>>3、铁死亡与肝脏损伤的关系

科学家运用多种基因敲除小鼠模型，首次发现高铁状态以及遗传性血色病铁过载可诱发肝脏(肝细胞及巨噬细胞)发生铁死亡，并且揭示了转运蛋白SLC7A11调控铁死亡的新机制，为肝脏损伤及血色病等系列重大疾病的防治提供了新思路。

>>>>4、铁死亡抑制子FSP1发现

2019年10月21日，研究热点铁死亡背靠背登顶Nature。GPX4抑制剂能够诱导肿瘤细胞发生铁死亡，但不同肿瘤细胞系对GPX4抑制剂反应效果相差很大，暗示细胞中还存在其他的铁死亡抑制子。加州大学伯克利分校James A. Olzmann教授与德国环境健康研究中心Marcus Conrad教授和维尔茨堡大学José Pedro Friedmann Angeli教授各自研究成果共同揭示了一个新的铁死亡抑制子FSP1。

3、铁死亡常见检测方法

>>>>1、形态学观察

(1) 细胞形态观察:利用透射电镜直接对细胞形态进行观察，细胞发生铁死亡时线粒体变小以及线粒体膜密度较大;
(2) 线粒体形态观察:向细胞内转染LifeAct-GFP荧光蛋白，一定时间后通过有丝分裂追踪器观察线粒体的形态。

>>>>2、新陈代谢检测

(1) 细胞活性检测:CCK-8;
(2) 细胞内铁水平检测:可以使用PGSK探针检测，通过流式细胞术或共聚焦显微镜监测活细胞内铁含量的细胞膜透性染料，在铁死亡的细胞中，PGSK的绿色荧光会减弱;
(3) 活性氧水平检测:通过C11-BODIPY探针检测，在铁死亡细胞中，探针会由红色转化为绿色;
(4) 线粒体膜电位检测: 可以使用TMRE荧光染料检测，TMRE能够特异性标记有活性的线粒体，是一种细胞膜可穿透性的，正电荷的，橘红色荧光染料。当线粒体膜电位降低时，荧光减弱;
(5) qPCR/Western Blot检测:检测细胞内与铁死亡相关的因子变化，例如Cox2, ACSL4和NOX1在铁死亡细胞中表达上调; GPX4, SLC7A11, Ferritin和Ferritin Light Chain在铁死亡细胞中表达下调。

铁代谢与铁死亡研究代表性文章及综述（小编推荐）

1、A Red Carpet for Iron Metabolism. PMID: 28129536
2、Regulators of Iron Homeostasis:New Players in Metabolism,Cell Death, and Disease. PMID: 26725301
3、Two to Tango: Regulation of Mammalian Iron Metabolism. PMID: 20603012
4、Ferroptosis: process and function.
5、Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. PMID: 28985560
6、Ferroptosis: An Iron-Dependent Form of Non-Apoptotic Cell Death.

ABclonal针对铁死亡研究，利用第四代重组兔单抗技术（图6）制备了Transferrin （A19130），Ferritin（A19544），Ferritin Light Chain（货号A11241），SLC7A11（货号A2413），GPX4（货号A11243），Heme Oxygenase 1（货号A19062）和HMGB1（货号A19529）高质量重组兔单抗。