1、自噬与疾病

目前与自噬相关研究最热的三类疾病是肿瘤、神经退行性疾病和免疫性疾病。其中在肿瘤的作用争论最大，扮演着双刃剑的角色。主要表现自噬基因敲除的动物自发肿瘤增多（正常的细胞自噬作用能有效防控肿瘤），相反自噬基因敲除后，增加了化疗、放疗、免疫治疗的敏感性（肿瘤细胞的自噬作用能帮助肿瘤细胞适应各种恶劣环境的挑战）。

 

2、自噬检测方法

文献最常用的自噬检测方法是蛋白印迹检测自噬标志物(Autophagy Marker)LC3的转换（LC3-II/LC3-I）以及荧光显微镜检测LC3点状聚集物的形成。LC3最初发现时被认为是微管关联蛋白1A和1B(microtubule-associated proteins 1A and 1B)的亚基，被称为MAP1LC3，随后发现LC3与酵母蛋白Apg8/Aut7/Cvt5具有较高相似性，并在自噬过程中起重要作用。哺乳动物中有三种LC3同工型蛋白（LC3A、LC3B和LC3C），它们在自噬过程中发生翻译后修饰。合成后的LC3在其羧基端被Atg4迅速剪切，产生胞浆定位的LC3-I（分子量16KD）。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系脂质化，产生分子量为14KD的LC3-II，并定位到自噬小体中（图1）。这样，自噬小体中存在的LC3，和低分子量的LC3-II都被当做细胞发生自噬的Marker，并且LC3-II的含量和发生自噬的程度成正相关。LC3B作为LC3的一种，同样可以用作自噬的Marker。

图1 自噬信号通路示意图

 

3、LC3检测注意事项

目前大部分LC3抗体选择的抗原位于N端，PE基团的加入可能会使得N端蛋白构象变化，导致抗体对LC3的亲和力增强，所以LC3-II条带深并不能代表该样本处于高自噬状态。另外，LC3-I对冻融比较敏感，容易在SDS上样缓冲液降解。所以在做半定量检测时，除了使用LC3-II/LC3-I的比值外，也可以配合使用LC3-II与管家蛋白的比值进行半定量。由于LC3是脂化和膜相关蛋白，在细胞裂解时，可在冰上短暂超声，以促进蛋白溶解，使得LC3顺利从膜上解离。此外LC3-I的分子量约16KD，LC3-II在电泳后停留在14KD处，LC3-I和LC3-II均为小分子量蛋白，且差距仅2KD，所以在WB时要注意使用高浓度分离胶进行分离（建议约15%），转膜时使用小孔径0.2μm的 NC膜，采用恒流200mA，转膜40min即可。

★特别注意：LC3-I/II的形成和降解是一个动态过程，瞬时LC3-II表达不能反映自噬程度，需要配合使用工具药（如氯喹）分析自噬变化。另外需要查询细胞/组织中各亚型的表达谱，选择合适靶标的抗体。

 

4、LC3B重组兔单抗

图2 第四代重组兔单抗制备流程

ABclonal第四代重组兔单克隆抗体制备采用创新的细胞分选，富集，生物信息学，和重组单克隆抗体技术，直接从B细胞中获得理想的兔单克隆抗体。ABclonal在加强自身抗体升级的同时，也可对外承接兔单抗定制服务（图2）。

LC3B重组兔单抗产品优势

✔多物种多应用（Human/Mouse/Rat, WB/IHC/IF）；
✔特应性好（药物刺激后WB准确检测到LC3B转换（LC3B-II/LC3B-I），IF观察到自噬体，KO验证）；
✔批次更稳定（抗体编码序列已知，质粒保存，重组表达方式获得抗体）；
✔性价比高（可回收利用）。

 

5、A19665 LC3B rabbit mAb数据展示

为了助力自噬相关研究，ABclonal研发和生产了众多高质量自噬相关抗体（表1）。

 

6、表1 自噬抗体list（节选）