样本DNA的低质量一直是限制NGS应用的瓶颈之一，很多困难样本如FFPE样本、法医样本、微量样本因其自身的特性，存在着很大的建库失败风险。单链DNA建库技术是一种可以极大的改善低质量和微量DNA样本建库效果的技术方案，该技术能以单链DNA（ssDNA，single strand DNA）为模板构建文库，可以兼容低至10 pg DNA起始量的DNA文库构建。另外，利用单链DNA建库技术进行DNA甲基化文库的构建，能有效增加甲基化测序的灵敏度和准确性，降低测序成本。
1、单链DNA建库的原理和步骤
经典的DNA文库构建策略是在片段化的dsDNA（double strand DNA）两端加上测序接头，然后通过对应引物的PCR步骤实现文库的富集。然而在超低起始量以及严重降解样本中，完整的dsDNA分子数较少，接头连接的效率较低，进而导致建库失败风险较高。
单链DNA文库的构建策略是在文库构建之前，先将样本中片段化的dsDNA变性成为ssDNA，然后直接在ssDNA的3’端加上T7接头，再通过第二链合成以及对应引物的PCR，实现文库的补充完整和富集。这种直接在ssDNA末端加接头的方法，可以使得文库构建不依赖于T/A连接技术，不再受限于DNA末端的完整性、DNA起始量和接头/样本的浓度比例等多种因素，实现了DNA连接效率的最大化，非常适合于超低起始量以及严重降解样本的文库构建。
单链DNA建库的基本步骤
□ 预处理：通过高温孵育将Double Stranded DNA变为Single Stranded DNA，及保持单链DNA结构展开状态；
□ T7 Tailing & Ligation：可以快速高效地将T7 Truncated Adapter连接到Single Stranded DNA的3’端；
□ Second Strand Synthesis：使用DNA延伸酶完成Single Stranded DNA互补链的合成；
□ T5 Adapter Ligation：可以高效地将T5 Truncated Adapter连接到Double Stranded DNA的5’端；
□ 文库扩增：用高保真、低偏向性、高产量的PCR反应液对文库进行富集
| 单链DNA建库流程 VS 传统建库流程
Scale ssDNA Lib Prep Techniques能直接高效的将T7 Truncated Adapter连接到Single Stranded DNA的3‘端，不依赖于T/A连接技术，不再受限于DNA末端的完整性，DNA起始量，接头浓度等，实现了DNA连接效率的最大化
2、单链DNA甲基化建库的原理
DNA甲基化是指DNA分子上的CpG双核苷酸中的胞嘧啶（C）处于甲基化状态，通常真核生物基因组中的CpG以两种形式分布：
一种是散在分布于基因间区，该类型的CpG 70-90%的CpG处于甲基化状态，这种以散在形式分布的CpG甲基化对于维持基因组稳定性非常重要，而该类型的CpG甲基化水平异常下降可能会引发癌症；
另外一种是以“CpG岛”的形式成簇的分布于基因的启动子区和上游调控区域，现有研究共识是“CpG岛”的甲基化调控对于基因的表达调控非常重要：“CpG岛”的甲基化与基因表达抑制相关，而“CpG岛”的去甲基化则与基因表达激活相关。人类的很多肿瘤都是由癌基因的去甲基化或者抑癌基因的甲基化造成的。
因此，DNA的甲基化对于肿瘤诊断以及基础科学的研究都有着重要意义。
全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）被认为是DNA甲基化测序的金标准。经典的WGBS的策略是先构建普通的DNA文库，然后用 bisulfite（重亚硫酸盐）处理已经构建好的文库，使得文库分子中那些未甲基化的C变成T，最后对这些转化后的文库进行测序，并通过和参考基因组进行比对，就能鉴定到哪些CpG是甲基化的，哪些是非甲基化的。然而，在经典的WGBS实验步骤中，bisulfite处理，以及后续的脱氨基和脱磺酸基处理会使得接近90%的文库分子降解，因此WGBS文库构建需要较高的模板起始量（微克级），而且最后得到的数据冗余率很高，造成很大的测序数据浪费。
单链DNA甲基化文库构建是在先用bisulfite处理模板，然后再利用单链DNA文库构建技术进行文库构建。相比于经典的WGBS，单链DNA甲基化文库构建技术能有效的降低模板起始量以及冗余数据量，显著的降低测序成本。
单链DNA甲基化文库构建步骤
□ Bisulfite处理（gDNA，cfDNA/ctDNA，CHIP DNA）
□ 变性：95℃孵育2min，将片段化的双链DNA充分解链，高温孵育结束，立即冰上降温，防止出现DNA复性；
□ T7接头连接：37℃孵育15min，进行单链DNA的3’接头的连接，95℃孵育2min，将Met T7 Enzyme Mix失活，防止出现非特异性连接；
□ 二链合成：使用DNA延伸酶完成单链 DNA互补链的合成；
□ T5接头连接：延伸后的dsDNA5’末端连接truncated T5接头；
□ PCR扩增：利用高保真的扩增酶完成DNA文库的扩增，不同样本使用不同的PCR Index，方便测序。
| 单链DNA甲基化文库构建流程
3、ABclonal 的单链DNA和单链甲基化文库构建解决方案
ABclonal（爱博泰克）经过多年的技术探索，目前已经形成了➤六大系列NGS建库方案，其中就包含了基于单链DNA建库技术的Scale系列建库试剂盒，该系列产品的应用场景与模板如下：
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部分数据展示
| 200 ng FFPE DNA甲基化文库峰图
用Scale Methyl-DNA Lib Prep Kit对200 ng FFPE DNA进行甲基化文库构建，文库产量和文库峰形均有较好的表现；
| 10ng cf DNA甲基化文库峰图
用Scale Methyl-DNA Lib Prep Kit对10 ng cfDNA进行甲基化文库构建，文库产量和文库峰形均有较好的表现；
| FFPE样本的捕获测序结果
单链Scale ssDNA建库试剂盒在FFPE样本的捕获测序中表现更为优异，Duplicate更低，On Target_%更高。
| Human困难样本中碱基偏好性分析
ABclonal Scale ssDNA-seq表现更为稳定，碱基偏好性更低。
