什么是ABclonal ?

ABclonal-第四代重组兔单抗先行者!

还在为细胞存活实验“五劳七伤”吗?文末有惊喜!

 

聚焦

在细胞存活实验中,能用到的方法很多,大家总会特别好奇,为啥隔壁师姐做的又快又好,自己做的很慢,更要命的是结果还不稳定,已经被折磨的“五劳七伤”。总是感慨:时间紧,毕业难。煎熬一段时日无果,忍不住向师姐求助,原来不是自己不努力,只是方法学有问题。我还在用陈旧的MTT,看来真是Out了,实验繁琐,结果不稳定,指望着通过多尝试多做来出奇迹怕是很难。师姐用的CCK-8只花一个小时就得到了MTT需要四个小时才能得到的结果,而且精准,重复性好。对于着急毕业的我们,实在是耗不起,最糟心的是现在很多SCI根本不认可MTT结果。

古人云:“工欲善其事必先利其器”。看来做实验光埋头苦干不行,还得学会运用合适的检测试剂盒,这样才能事半功倍。

ABclonal针对细胞存活测定,研发了一款快速、高灵敏度的CCK-8试剂盒(货号:RM02823)。对细胞的毒性极小,完全可以测完细胞增殖或药物毒性后再继续用细胞进行下游实验。下面小编就来为大家介绍一下这款CCK-8 的具体情况。

Cell Counting Kit-8,简称CCK-8试剂盒或CCK8试剂盒,是一种基于高水溶性的四唑盐(WST-8)而广泛应用于细胞活性和细胞毒性检测的快速、高灵敏度试剂盒。

WST-8[化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐],它在电子载体1-Methoxy PMS的作用下,被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan dye)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比(图1),因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。细胞增殖越快,活细胞数量越多,则颜色越深;细胞毒性越大,活细胞数量越少,则颜色越浅。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值,能间接反映活细胞数量。CCK-8的检测灵敏度高于其他方法,如MTT,XTT,MTS或WST-1等。

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图1:CCK-8检测原理图 (EC=electron coupling reagent,即电子耦合试剂)

 

CCK-8法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较

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产品特点

1、相比于MTT,MTS或WST-1,CCK-8更敏感
2、细胞毒性很低,测完可以继续用细胞进行下游实验
3、步骤更简单,无需有机溶剂
4、即开即用,省时省力
5、稳定性强,重复性好
6、灵敏度优于竞品TR
7、货期短,性价比高

 

竞品数据对比

CCK-8灵敏度测试

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293T细胞,96孔板铺置不同密度的细胞,12小时后,分别使用上述品牌CCK-8 Kit进行测试,ABclonal CCK8试剂盒灵敏度优于竞品TR。

 

CCK-8测定细胞抑制作用

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L929细胞,96孔板铺置不同密度的细胞,12小时后,加入TNFa试剂和放线菌素D处理细胞,24小时后,使用CCK-8 Kit产品进行测试,酶标仪读取OD值,测得EC50为20pg/mL,R2=0.997。

 

常见FAQs

1、CCK-8是否对细胞产生毒性?

CCK-8的毒性非常低,在CCK-8测定完成后,可以继续进行下游实验。(如果细胞极为稀少,不建议把CCK-8测定过的细胞用于其它实验,防止实验结果不精准。)

2、CCK-8能否用于细胞染色?

CCK-8不能用于细胞染色,CCK-8是在细胞外被还原成黄色甲臜产物,不会进入细胞内对细胞进行染色。

3、如何设置空白对照?

在不含有细胞的培养基中加入CCK-8,酶标仪检测450 nm的吸光度;若做药物刺激实验,可在不含细胞、含药物的培养基中加入CCK-8。酶标仪检测450 nm的吸光度作为空白对照。

4、哪些物质会干扰CCK-8的测定?

CCK-8 测定的原理是依赖活细胞线粒体中的脱氢酶活性,凡是影响脱氢酶活性的条件或化学物质均可能导致实际活细胞数与测定活细胞数之间存在差异。WST-8 可能与还原剂反应生成 WST-8 甲臜。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。

5、CCK-8试剂盒能否反复冻融?

试剂盒反复冻融会导致背景增加,干扰检测结果。如需频繁使用,请将试剂盒储存在0-5℃空间。

6、在做药物刺激实验时,药物对测定是否有影响?

如果药物有还原性,则会与CCK-8发生反应,影响吸光度;药物中金属离子的存在可能会影响CCK-8的灵敏度。终浓度为1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会分别抑制5% 、15% 、90%的显色反应,使灵敏度降低。如果终浓度是10 mM 的话,将会100%抑制。

7、每个孔接种细胞数量控制在多少数量合适?

对于贴壁细胞,每孔至少需要 1000 个细胞( 100 μL 培养基)。对于白细胞,由于灵敏度较低,每孔至少需要 2500 个细胞( 100 μL 培养基)。推荐的 96 孔板每孔最大细胞数为 25000。如果使用 24 孔或 6 孔板进行该检测,请计算相应的每孔的细胞数, 并调整 CCK-8 的体积,使其为每孔总液体体积的 10%。

8、如果没有450 nm的滤光片,是否有其他替代?

如果实验室没有 450 nm 滤光片。可以使用吸光度在 430 和 490 nm 之间的滤光片, 只不过450nm 滤光片具有最佳灵敏度。测量 450 nm 处的吸光度,如果您需要进行双波长测定,作为参考波长可以测定 650 nm处的吸光度。

9、培养基中的酚红是否影响实验结果?

培养基中的酚红不会影响实验结果,酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。由于酚红颜色和CCK-8颜色接近,添加时请注意,不要漏加CCK-8。

10、如果吸光度值太低怎么办?

适当增加细胞数量或延长加入CCK-8溶液后的反应时间。比如白细胞灵敏度较低,因此可能需要较长的孵育时间(长达 4 小时)或大量细胞( 约105细胞/孔)。建议先做预实验,优化细胞数量与荧光值之间的关系。

11、如果吸光度值太高怎么办?

适当减少细胞数量或缩短加入CCK-8溶液后的孵育时间。建议先做预实验,优化细胞数量与荧光值之间的关系。

12、CCK-8都可以做哪些应用?

药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。

13、该产品能否测酵母细胞?

该试剂盒可用于大肠杆菌,但不能用于酵母细胞。

 

 

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