Taqman qPCR实验技术

2019年12月16日 | 评论0 | 阅读10,680 | 点赞8

导读

荧光定量PCR（qPCR）是大家常用的分子生物学技术，根据实验方法的不同，qPCR可以分为染料法（SYBR Green法为代表）和探针法（Taqman法为代表）。因为操作简单，价格便宜，SYBR Green法qPCR 受到了更为普遍的使用。但是SYBR Green法并非万能的，在很多时候SYBR Green无法满足实验的需要，这个时候，你需要考虑一下Taqman法。Taqman qPCR特异性强，信噪比高，能够适用于多重qPCR，在实验中合理的使用Taqman qPCR，能让你的数据更具说服力！今天，小编就带你认识一下Taqman qPCR。

1、什么是Taqman qPCR

Taqman法qPCR的原理如图1所示，Taqman是一段短的单链DNA探针，能够和模板DNA进行退火。Taqman探针的5’端带有一个报告基团（R），3’端带有一个猝灭基团（Q）。报告基团所发出的荧光会被猝灭基团所吸收，因此正常情况下荧光探针是不会发出荧光的。在PCR的延伸过程中，DNA聚合酶沿着模板链从5’到3’的方向合成新链，当DNA聚合酶到达Taqman探针结合位点时，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性会将Taqman探针进行水解，导致Taqman探针的报告基团脱离了猝灭基团，从而发出荧光。可以根据荧光值的高低，判断PCR过程中目的片段产生的多少，从而实现对目的基因进行实时定量。

在Taqman qPCR中，上下游引物只有扩增探针所结合的片段时，才会产生荧光，非特异扩增是不会产生荧光的，因此Taqman qPCR的特异性非常好。另外，可以用不同的报告基团，标记多个荧光探针，实现在一管PCR体系中，同时对多个基因进行定量，这样不仅实验的通量大大提高，而且实验的一致性也更好。

图1：Taqman qPCR的原理

2、什么时候需要使用探针法qPCR

相对于SYBR Green qPCR，探针法qPCR需要设计和合成特异的荧光探针，增加了设计难度和实验成本。但是，当你遇到如下情况时，Taqman qPCR是你的第一选择。

>>>1.基因检测

以Taqman为代表的探针法qPCR最常用的应用场景就是基因检测，包括医疗诊断，环境微生物检测，转基因检测等。这些应用场景对结果的特异性要求非常高，而染料法qPCR的结果很容易受到非特异性扩增的干扰，因此一般都是使用Taqman qPCR进行检测。

>>>>2.很难设计特异性引物

qPCR对引物的扩增效率要求很高，如果用相对定量法（Livak法）进行数据分析，需要保证引物的扩增效率在90%到105%之间，否则最后得到的数据不真实。然而有时候，为了保证扩增的特异性，只能在某个特异位点设计引物，从而牺牲了一些其它的引物设计原则，比如GC含量过高，引物有二级结构等，导致qPCR扩增的效率过低。这种情况下用Taqman qPCR可以很好的解决这一点，因为Taqman 探针本身就可以保证特异性，因此设计引物的时候有更多灵活性，更容易设计扩增效率高的引物对。

>>>>3.发表高水平文章

由于Taqman法比SYBR Green法具有更好的特异性，实验结果更接近真实，所以很多高水平文章更青睐于Taqman qPCR的结果。特别是一些关键基因的关键结果，如果有Taqman qPCR的数据，会给你的文章加分不少。

3、用探针法进行qPCR需要注意什么

探针法qPCR虽好，但是使用时还是有很多需要注意的地方。以Taqman qPCR为例，我们总结了如下几点值得注意：

>>>>1.引物和探针设计：

Taqman探针一般长20-24 bp，Tm值比引物高8-10℃，一般为60-70℃左右。探针的5’末端的第一个碱基不能是G，否则，即使报告基团脱离猝灭基团也不会发出荧光。设计引物和Taqman探针可以使用专门的工具如 beacon designer（http://www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/index.html），可以大大的简化设计难度。另外，报告基团和猝灭基团的选择，也要遵循一定的原则，图2总结了一些常见的报告基团和猝灭基团的组合形式。

猝灭基团	报告基团
TAMRA	FAM、HEX、TET、JOE等
Ecllpse	FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、ROX等
BHQ/MGB	FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5等

图2：Tqaman猝灭基团和报告基团的组合形式

>>>>2.扩增程序和体系的优化：

Taqman qPCR只能用两步法扩增，因为需要保证探针和模板在延伸过程中保持结合。一般，Taqman qPCR的退火和延伸温度为55-60℃，比Taqman探针的Tm值低5-10 ℃。另外，需用标准曲线评价Taqman qPCR的灵敏性和扩增效率，一般扩增效率需要达到90%-105%，线性相关性R2> 0.98。由于Taqman探针合成较贵，所以可以在合成探针前，用SYBR Green qPCR进行扩增效率和灵敏性的评价和优化。如果qPCR扩增效率或者灵敏性太低，可以通过通过调整体系的酶，dNTP以及Mg2+的浓度进行反应体系的优化。

4、ABclonal Entrans probe qPCR 系列产品

货号	名称	组分	特性
RK21208	Entrans 2X qPCR Probe Master Mix	Entrans 2X qPCR Probe Master Mix	单重/多重，预混液，实验方便
RK21209	Entrans qPCR Probe Kit	Entrans Taq DNA Polymerase	单重/多重，单酶+buffer，可以根据实验优化酶的投入量
RK21209	Entrans qPCR Probe Kit	4X qPCR Probe Buffer	单重/多重，单酶+buffer，可以根据实验优化酶的投入量
RK21210	Entrans qPCR Probe Set	Entrans Taq DNA Polymerase	单重/多重，单酶+buffer + dNTPs and Mg²⁺可以根据实验，优化酶，dNTP，Mg²⁺的投入量
		4X qPCR Probe Buffer II (No dNTPs and Mg²⁺)
		dNTPs
		MgCl₂₊

5、数据展示

| 高灵敏性，宽扩增范围

小鼠gDNA为模板，GAPDH基因，VIC探针通道检测，模板投入量依次为10²、10¹、10⁰、10^-1、10^-2、10^-3 ng和NTC，分别对应3*10⁴， 3*10³ ， 3*10² ， 3*10¹ ， 3*10⁰ ， 3*10^-1 ， 0 个拷贝数。ABclonal Probe qPCR 产品 PCR扩增效率达93%，线性相关系数0.999，Ct值平均标准偏差为0.032。