什么是ABclonal ?

ABclonal-第四代重组兔单抗先行者!

Taqman qPCR实验技术

 

导读

荧光定量PCR(qPCR)是大家常用的分子生物学技术,根据实验方法的不同,qPCR可以分为染料法(SYBR Green法为代表)和探针法(Taqman法为代表)。因为操作简单,价格便宜,SYBR Green法qPCR 受到了更为普遍的使用。但是SYBR Green法并非万能的,在很多时候SYBR Green无法满足实验的需要,这个时候,你需要考虑一下Taqman法。Taqman qPCR特异性强,信噪比高,能够适用于多重qPCR,在实验中合理的使用Taqman qPCR,能让你的数据更具说服力!今天,小编就带你认识一下Taqman qPCR。

 

1、什么是Taqman qPCR

Taqman法qPCR的原理如图1所示,Taqman是一段短的单链DNA探针,能够和模板DNA进行退火。Taqman探针的5’端带有一个报告基团(R),3’端带有一个猝灭基团(Q)。报告基团所发出的荧光会被猝灭基团所吸收,因此正常情况下荧光探针是不会发出荧光的。在PCR的延伸过程中,DNA聚合酶沿着模板链从5’到3’的方向合成新链,当DNA聚合酶到达Taqman探针结合位点时,DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性会将Taqman探针进行水解,导致Taqman探针的报告基团脱离了猝灭基团,从而发出荧光。可以根据荧光值的高低,判断PCR过程中目的片段产生的多少,从而实现对目的基因进行实时定量。

在Taqman qPCR中,上下游引物只有扩增探针所结合的片段时,才会产生荧光,非特异扩增是不会产生荧光的,因此Taqman qPCR的特异性非常好。另外,可以用不同的报告基团,标记多个荧光探针,实现在一管PCR体系中,同时对多个基因进行定量,这样不仅实验的通量大大提高,而且实验的一致性也更好。

《Taqman qPCR实验技术》

图1:Taqman qPCR的原理

 

2、什么时候需要使用探针法qPCR

相对于SYBR Green qPCR,探针法qPCR需要设计和合成特异的荧光探针,增加了设计难度和实验成本。但是,当你遇到如下情况时,Taqman qPCR是你的第一选择。

>>>1.基因检测

以Taqman为代表的探针法qPCR最常用的应用场景就是基因检测,包括医疗诊断,环境微生物检测,转基因检测等。这些应用场景对结果的特异性要求非常高,而染料法qPCR的结果很容易受到非特异性扩增的干扰,因此一般都是使用Taqman qPCR进行检测。

>>>>2.很难设计特异性引物

qPCR对引物的扩增效率要求很高,如果用相对定量法(Livak法)进行数据分析,需要保证引物的扩增效率在90%到105%之间,否则最后得到的数据不真实。然而有时候,为了保证扩增的特异性,只能在某个特异位点设计引物,从而牺牲了一些其它的引物设计原则,比如GC含量过高,引物有二级结构等,导致qPCR扩增的效率过低。这种情况下用Taqman qPCR可以很好的解决这一点,因为Taqman 探针本身就可以保证特异性,因此设计引物的时候有更多灵活性,更容易设计扩增效率高的引物对。

>>>>3.发表高水平文章

由于Taqman法比SYBR Green法具有更好的特异性,实验结果更接近真实,所以很多高水平文章更青睐于Taqman qPCR的结果。特别是一些关键基因的关键结果,如果有Taqman qPCR的数据,会给你的文章加分不少。

 

3、用探针法进行qPCR需要注意什么

探针法qPCR虽好,但是使用时还是有很多需要注意的地方。以Taqman qPCR为例,我们总结了如下几点值得注意:

>>>>1.引物和探针设计:

Taqman探针一般长20-24 bp,Tm值比引物高8-10℃,一般为60-70℃左右。探针的5’末端的第一个碱基不能是G,否则,即使报告基团脱离猝灭基团也不会发出荧光。设计引物和Taqman探针可以使用专门的工具如 beacon designer(http://www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/index.html),可以大大的简化设计难度。另外,报告基团和猝灭基团的选择,也要遵循一定的原则,图2总结了一些常见的报告基团和猝灭基团的组合形式。

猝灭基团 报告基团
TAMRA FAM、HEX、TET、JOE等
Ecllpse FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、ROX等
BHQ/MGB FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5等

图2:Tqaman猝灭基团和报告基团的组合形式

>>>>2.扩增程序和体系的优化:

Taqman qPCR只能用两步法扩增,因为需要保证探针和模板在延伸过程中保持结合。一般,Taqman qPCR的退火和延伸温度为55-60℃,比Taqman探针的Tm值低5-10 ℃。另外,需用标准曲线评价Taqman qPCR的灵敏性和扩增效率,一般扩增效率需要达到90%-105%,线性相关性R2> 0.98。由于Taqman探针合成较贵,所以可以在合成探针前,用SYBR Green qPCR进行扩增效率和灵敏性的评价和优化。如果qPCR扩增效率或者灵敏性太低,可以通过通过调整体系的酶,dNTP以及Mg2+的浓度进行反应体系的优化。

 

4、ABclonal Entrans probe qPCR 系列产品

货号 名称 组分 特性
RK21208 Entrans 2X qPCR Probe Master Mix Entrans 2X qPCR Probe Master Mix 单重/多重,预混液,实验方便
RK21209 Entrans qPCR Probe Kit Entrans Taq DNA Polymerase 单重/多重,单酶+buffer,可以根据实验优化酶的投入量
4X qPCR Probe Buffer
RK21210 Entrans qPCR Probe Set Entrans Taq DNA Polymerase 单重/多重,单酶+buffer + dNTPs and Mg2+可以根据实验,优化酶,dNTP,Mg2+的投入量
4X qPCR Probe Buffer II (No dNTPs and Mg2+)
dNTPs
MgCl2+

 

5、数据展示

| 高灵敏性,宽扩增范围

《Taqman qPCR实验技术》

小鼠gDNA为模板,GAPDH基因,VIC探针通道检测,模板投入量依次为102、101、100、10-1、10-2、10-3 ng和NTC,分别对应3*104, 3*103 , 3*102 , 3*101 , 3*100 , 3*10-1 , 0 个拷贝数。ABclonal Probe qPCR 产品 PCR扩增效率达93%,线性相关系数0.999,Ct值平均标准偏差为0.032。

| 单重 VS 多重

《Taqman qPCR实验技术》

小鼠gDNA为模板,GAPDH基因,VIC探针通道检测;PPIA基因,TAMRA探针通道检测。ABclonal Probe qPCR 产品在单重与多重测试中Ct值与信号强度一致。

| 反复冻融实验

《Taqman qPCR实验技术》

小鼠gDNA为模板,GAPDH基因,VIC探针通道检测100次冻融实验的扩增曲线图,其中每10次冻融循环进行取样, ABclonal Probe qPCR 产品所有扩增曲线基本重合,Ct值前后差异不大。

| 储藏稳定性实验

《Taqman qPCR实验技术》

小鼠gDNA为模板,GAPDH基因,VIC探针通道检测, ABclonal Probe qPCR 产品 置于37℃ 四周后与对照相比,Ct值相差不大,扩增效率等其他参数基本不变。

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