稻米的贮藏蛋白主要由谷蛋白（glutelin）、醇溶蛋白（prolamin）、球蛋白（globulin）构成，其中谷蛋白含量最高（约占总贮藏蛋白含量的60-80%），且赖氨酸含量丰富、易被人体消化吸收；反观醇溶蛋白（占总贮藏蛋白的10-20%）却因结构致密，很难被人体消化吸收。因此谷蛋白在水稻品质的分子育种研究中具有重要意义。

谷蛋白首先在内质网中以57KD的谷蛋白前体（glutelin precursors）形式合成，随后谷蛋白前体通过高尔基体，从反面高尔基体网（trans-Golgi network，TGN）以致密囊泡（Dense vesicles，DV）的形式被运输到贮藏液泡（protein storage vacuoles，PSV ），在贮藏液泡中被酶解加工成成熟的谷蛋白，并最终储存在蛋白体II中（protein body II，PBII）。

谷蛋白的合成、分选以及加工过程涉及到多个调控因子的协同作用，这些调控因子的鉴定以及功能解析对于水稻品质改良至关重要。万建民院士课题组前期已经在这一领域取得诸多重要成果，相继在Plant Cell和Molecular Plant等期刊上报道了谷蛋白前体的后高尔基体分选调控因子GPA1/Rab5a, GPA2/VPS9a, GPA3和GPA4/Got1B，最近，万建民院士团队又在Plant Cell上发表文章：GPA5 Encodes a Rab5a Effector Required for Post-Golgi Trafficking of Rice Storage Proteins，该研究克隆到了一个新的谷蛋白前体后高尔基体分选调控关键因子GPA5（glutelin precursor accumulation5），能和GPA1(Rab5a)协同作用，共同调控致密囊泡和贮藏液泡的膜融合，该研究成果对于谷蛋白形成的分子机制以及水稻品质改良都有重要意义。中国农科院作物所任玉龙副研究员、南京农业大学王益华教授、王云龙博士后和潘天博士为论文共同第一作者。

 

1、GPA5参与调控致密囊泡（DV）向贮藏液泡（PSV）的运输

谷蛋白57H突变体是谷蛋白前体增加、成熟酸碱亚基含量减少的一类种质资源，是解析谷蛋白合成、分选以及沉积的理想遗传材料。根据Western Blot（分子伴侣蛋白PDI1-1和Bip1是否积累）以及细胞学表型，将57H突变体分为三类：1. 内质网输出缺陷突变体；2.后高尔基体分选缺陷突变体；3.谷蛋白剪切成熟突变体。

gpa5突变体就是一种新的57H材料，Western Blot实验发现gpa5中分子伴侣蛋白PDI1-1和Bip1在突变体中并没有积累，说明gpa5细胞中的蛋白能够正确折叠，内质网输出没有出现遗传，因此gpa5不属于第一类57H突变体；另外，细胞形态学观察结果也显示，gpa5突变体的谷蛋白成熟剪切没有缺陷，说明gpa5也不是第三类57H材料。进一步研究表明，gpa5中的谷蛋白前体并没有被正确的储存在蛋白体II种，而是被错误的运输到了细胞间隙（apoplast space）并以拟壁体（d paramural bodies，PMBs）的形式储存。这说明gpa5主要是谷蛋白前体的后高尔基体分选发生了紊乱，因此gpa5属于第二类57H突变体。用免疫胶体金技术结合透射显微镜，可以明显观察到GPA5蛋白定位在致密囊泡（DV）表面，并可能参与了致密囊泡和贮藏液泡的融合。因此GPA5的突变，会造成致密囊泡不能正确的与贮藏液泡融合，却会导致致密囊泡错误的和细胞膜融合，最后使谷蛋白前体大量沉积在细胞间隙。

图1：gpa5突变体表型

 

2、GPA5是GPA1/Rab5a的下游效应因子

和GPA5一样，GPA1/Rab5a, GPA2/VPS9a也是两个重要的谷蛋白前体后高尔基体分选调控因子。其中GPA1是一个GDP/GTP结合蛋白，GPA1结合GDP时是无活性状态，而结合GTP是活性状态，GPA1-GDP被激活成GPA1-GTP之后能够定位在致密囊泡（DV）上，并介导致密囊泡和贮藏液泡的融合。GPA2是GPA1的鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEF），能够帮助GPA1-GDP激活成为有活性的GPA1-GTP，因此GPA1、GPA2和GPA5都在致密囊泡的分选过程中具有重要作用，这三个调控因子也有可能处于同一调控通路。

遗传学实验结果显示，GPA5的膜定位特性需要依赖GPA1和GPA2。GPA1或者GPA2的突变，会导致GPA5定位于细胞质中，而不是定位在膜上；然而反过来GPA5突变，并不会影响GPA1的亚细胞定位，这说明GPA5可能处于GPA1的下游。进一步实验结果显示，GPA5能和GPA1以及GPA1-GTP互作，但是不能和GPA-GDP互作，因此，GPA5很有可能是GPA1的下游效应因子，GPA5和GPA1-GTP结合后才具有了膜定位的特性。

图2：多种蛋白互作实验表明GPA5能和GPA1（Rab5a）以及GPA1-GTP互作，但是不能和GAP1-GDP互作

 

3、GPA5能和贮藏液泡表面（PSV）的栓系复合物互作

栓系复合物CORVT和SNARE复合体在介导致密囊泡（DV）和贮藏液泡(PSV)的融合过程中具有重要作用。免疫共沉淀联合质谱分析证明，GPA5能和CORVT的组成亚基（VPS3、VPS8、 VPS11、 VPS16、 VPS18、 VPS33）以及SNARE复合体的组成亚基（VAMP727， Qa-SYP22, Qb-VTI11, and Qc-SYP5）互作。而用这些亚基的抗体进行WB也验证了质谱结果的正确性。这说明GPA5能够通过与贮藏液泡表面的栓系复合物CORVT和SNARE互作，而介导致密囊泡被正确的运输到贮藏液泡表面，并使二者融合。

图3：质谱和WB分析GAP5的免疫沉淀产物

 

4、GPA5的作用机制

综合这些实验结果，可以推导出GAP5的工作模型：GAP1（RAB5a）-GDP在GAP2（VSP9a）的作用下激活，形成GAP1-GTP，随后GAP1-GTP能够将GAP5招募到致密囊泡（DV）上，随后GAP5与栓系复合物CORVET以及Q-SNARE共同作用，从而促使了致密囊泡和贮藏液泡的融合，并使得谷蛋白前体释放到贮藏液泡中，发生酶解和剪切成成熟的谷蛋白，最终形成蛋白体II（图5）。

图4：GPA5调控谷蛋白后高尔基体分选的工作模型