分子诊断中的“无名英雄”：蛋白酶K

2020年8月25日 | 评论0 | 阅读6,292 | 点赞2

导言

我们身边有很多无名英雄，看似平凡，实则默默的为我们贡献了很多。蛋白酶K就是分子诊断行业里的“无名英雄”，虽然和行业里的那些“高大上”们相比，蛋白酶K显得很低调，以至于我们长期忽视了它的重要性。随着这次新冠疫情的爆发，蛋白酶K的需求量暴增，国内外的供应量远跟不上消耗量，大家才突然意识到蛋白酶K是如此的重要。

蛋白酶K有什么用

蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，具有蛋白水解酶活性，并能在一系列广泛的环境（pH（4-12.5），高盐缓冲液，70℃的高温等）中保持活性。另外，蛋白酶K的活性不受SDS、尿素、EDTA、盐酸胍、异硫氰酸胍等的抑制，且一定含量的去垢剂还可以增强蛋白酶K的活性。在医疗（病毒与微生物消杀）、食品（肉类嫩化）、皮革（毛发软化）、酿酒（酒类澄清）、氨基酸制备（降解羽毛）、核酸提取、原位杂交等方面，蛋白酶K均有应用。而其中最为常用的应用是核酸提取。

蛋白酶K能够酶解样本中的各类蛋白质，包括那些与核酸紧密结合的组蛋白，从而使得核酸能从样品中释放，游离到提取液中，便于下一步的抽提和纯化。在病毒核酸检测中，蛋白酶K是病毒采样液中的重要组分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，这样在运输和检测阶段更安全；另外，蛋白酶K还可以降解RNA酶，防止病毒RNA的降解，有利于核酸检测。

蛋白酶K的一夜成名

不管是在科研领域，还是在IVD领域，核酸提取都是最为基础的实验，因而蛋白酶K一直都是非常重要的存在。然而过去，蛋白酶K的知名度远不及它所发挥的作用，这其中很大一部分原因是因为蛋白酶K的供需关系非常稳定，很少有人会认为蛋白酶K的供给会是一个问题。

随着新冠疫情的爆发，核酸检测的需求激增，截止2020年六月下旬，中国已经完成了近9000万人次的新冠检测，而在全球范围内，这个数字更加惊人。在核酸提取实验中蛋白酶K的工作浓度大约是50-200 μg/mL，一般情况下，提取一个样本的核酸大约需要100 μg的蛋白酶K ，而在实际使用过程中，为了增加核酸提取效率，经常会将蛋白酶K加量使用。新冠病毒的核酸检测带来了大量的蛋白酶K需求，蛋白酶K原有的供需平衡被迅速打破，蛋白酶K一夜之间成为了重要的防疫物资。

蛋白酶K生产难点

虽然随着疫情的发展，蛋白酶K的重要价值被人们所重视，然而尴尬的是，由于蛋白酶K的过度低调，以至于国内很少有企业涉猎过蛋白酶K的生产，当人们想建立蛋白酶K的生产工艺时，却发现蛋白酶K是一个极其特殊的蛋白，短时间内扩大蛋白酶K的产能极具挑战性

蛋白酶K的大规模生产面临着如下难点

1、表达量低

蛋白酶K能够非特异性的降解大多数蛋白，对于表达宿主细胞造成严重毒性，因此蛋白酶K的表达量一般都很低。筛选高表达蛋白酶K的表达系统和菌株，一般需要较长的周期。

2、色素和核酸的残留

大规模发酵，引入大量色素和宿主核酸的残留，简单的纯化工艺很难除去这些杂质，而复杂的纯化又增加了成本和降低了回收率。

3、不稳定性

蛋白酶K不够稳定，自己能酶解自己，在无保护剂时，37℃很难长期稳定保存。

4、易沉淀

在制备蛋白酶K的冻干粉时，为了保证冻干粉中蛋白酶K的固含量较大，需要在高浓度时加入冻干保护剂，但是蛋白酶K在浓度达到20mg/mL及以上时，很容易聚集形成沉淀，这给蛋白酶K的高固含量冻干带来很大的困难。

5、投入大

蛋白酶K具有很强的蛋白酶活性，能够将实验室的其它蛋白酶解，所以蛋白酶K需要专门的产地、仪器设备、人员来进行研发与生产。

ABclonal 的蛋白酶K解决方案

ABclonal（爱博泰克）拥有成熟的蛋白表达与纯化平台，对于重组蛋白的表达纯化以及生产工艺优化具有丰富的经验。通过迅速组建研发队伍，目前已经攻克了蛋白酶K的大规模生产工艺，目前月产冻干粉达30 KG以上，产品性能稳定，酶比活性高，无宿主细胞色素及核酸残留，欢迎联系ABcloanl获取试用装（邮箱：cn.market@abclonal.com 电话400-999-6126）。

ABclonal的技术方案包括

● 采用多拷贝质粒整合的方式，筛选到表达量达到8g/L的高表达菌株，克服了蛋白酶K表达量低的问题；

● 通过建立多步纯化工艺，成功将蛋白酶K的宿主细胞色素和核酸残留去除到标准值以下；

● 通过高通量筛选保护缓冲液配方，筛选出了可以在37℃稳定保存蛋白酶K的缓冲液；

● 筛选缓冲液，克服了蛋白酶K在高浓度时容易聚集沉淀的问题、为蛋白酶K高固含量冻干打下了基础。