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ABclonal-第四代重组兔单抗先行者!

分子诊断中的“无名英雄”:蛋白酶K

 

导言

我们身边有很多无名英雄,看似平凡,实则默默的为我们贡献了很多。蛋白酶K就是分子诊断行业里的“无名英雄”,虽然和行业里的那些“高大上”们相比,蛋白酶K显得很低调,以至于我们长期忽视了它的重要性。随着这次新冠疫情的爆发,蛋白酶K的需求量暴增,国内外的供应量远跟不上消耗量,大家才突然意识到蛋白酶K是如此的重要。

 

蛋白酶K有什么用

蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶,具有蛋白水解酶活性,并能在一系列广泛的环境(pH(4-12.5),高盐缓冲液,70℃的高温等)中保持活性。另外,蛋白酶K的活性不受SDS、尿素、EDTA、盐酸胍、异硫氰酸胍等的抑制,且一定含量的去垢剂还可以增强蛋白酶K的活性。在医疗(病毒与微生物消杀)、食品(肉类嫩化)、皮革(毛发软化)、酿酒(酒类澄清)、氨基酸制备(降解羽毛)、核酸提取、原位杂交等方面,蛋白酶K均有应用。而其中最为常用的应用是核酸提取。

蛋白酶K能够酶解样本中的各类蛋白质,包括那些与核酸紧密结合的组蛋白,从而使得核酸能从样品中释放,游离到提取液中,便于下一步的抽提和纯化。在病毒核酸检测中,蛋白酶K是病毒采样液中的重要组分之一,蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活,这样在运输和检测阶段更安全;另外,蛋白酶K还可以降解RNA酶,防止病毒RNA的降解,有利于核酸检测。

 

蛋白酶K的一夜成名

不管是在科研领域,还是在IVD领域,核酸提取都是最为基础的实验,因而蛋白酶K一直都是非常重要的存在。然而过去,蛋白酶K的知名度远不及它所发挥的作用,这其中很大一部分原因是因为蛋白酶K的供需关系非常稳定,很少有人会认为蛋白酶K的供给会是一个问题。

随着新冠疫情的爆发,核酸检测的需求激增,截止2020年六月下旬,中国已经完成了近9000万人次的新冠检测,而在全球范围内,这个数字更加惊人。在核酸提取实验中蛋白酶K的工作浓度大约是50-200 μg/mL,一般情况下,提取一个样本的核酸大约需要100 μg的蛋白酶K ,而在实际使用过程中,为了增加核酸提取效率,经常会将蛋白酶K加量使用。新冠病毒的核酸检测带来了大量的蛋白酶K需求,蛋白酶K原有的供需平衡被迅速打破,蛋白酶K一夜之间成为了重要的防疫物资。

 

蛋白酶K生产难点

虽然随着疫情的发展,蛋白酶K的重要价值被人们所重视,然而尴尬的是,由于蛋白酶K的过度低调,以至于国内很少有企业涉猎过蛋白酶K的生产,当人们想建立蛋白酶K的生产工艺时,却发现蛋白酶K是一个极其特殊的蛋白,短时间内扩大蛋白酶K的产能极具挑战性

 

蛋白酶K的大规模生产面临着如下难点

1、表达量低

蛋白酶K能够非特异性的降解大多数蛋白,对于表达宿主细胞造成严重毒性,因此蛋白酶K的表达量一般都很低。筛选高表达蛋白酶K的表达系统和菌株,一般需要较长的周期。

2、色素和核酸的残留

大规模发酵,引入大量色素和宿主核酸的残留,简单的纯化工艺很难除去这些杂质,而复杂的纯化又增加了成本和降低了回收率。

3、不稳定性

蛋白酶K不够稳定,自己能酶解自己,在无保护剂时,37℃很难长期稳定保存。

4、易沉淀

在制备蛋白酶K的冻干粉时,为了保证冻干粉中蛋白酶K的固含量较大,需要在高浓度时加入冻干保护剂,但是蛋白酶K在浓度达到20mg/mL及以上时,很容易聚集形成沉淀,这给蛋白酶K的高固含量冻干带来很大的困难。

5、投入大

蛋白酶K具有很强的蛋白酶活性,能够将实验室的其它蛋白酶解,所以蛋白酶K需要专门的产地、仪器设备、人员来进行研发与生产。

 

ABclonal 的蛋白酶K解决方案

ABclonal(爱博泰克)拥有成熟的蛋白表达与纯化平台,对于重组蛋白的表达纯化以及生产工艺优化具有丰富的经验。通过迅速组建研发队伍,目前已经攻克了蛋白酶K的大规模生产工艺,目前月产冻干粉达30 KG以上,产品性能稳定,酶比活性高,无宿主细胞色素及核酸残留,欢迎联系ABcloanl获取试用装(邮箱:cn.market@abclonal.com 电话400-999-6126)。

 

ABclonal的技术方案包括

采用多拷贝质粒整合的方式,筛选到表达量达到8g/L的高表达菌株,克服了蛋白酶K表达量低的问题;

通过建立多步纯化工艺,成功将蛋白酶K的宿主细胞色素和核酸残留去除到标准值以下;

通过高通量筛选保护缓冲液配方,筛选出了可以在37℃稳定保存蛋白酶K的缓冲液;

筛选缓冲液,克服了蛋白酶K在高浓度时容易聚集沉淀的问题、为蛋白酶K高固含量冻干打下了基础。

《分子诊断中的“无名英雄”:蛋白酶K》

8月21日-8月23日,凭本文章截图到第十七届CACLP(南昌)A2-S03  ABclonal(爱博泰克)展台领取精美礼品一份。

 

部分蛋白酶K的数据

《分子诊断中的“无名英雄”:蛋白酶K》

ABclonal 蛋白酶K大量供应

《分子诊断中的“无名英雄”:蛋白酶K》

ABclonal 蛋白酶K样品

《分子诊断中的“无名英雄”:蛋白酶K》

ABclonal 蛋白酶K稳定性试验:常温下放置80 d活性不会有明显变化

《分子诊断中的“无名英雄”:蛋白酶K》

批次间稳定性测试:6个批次的蛋白酶K活性及浓度基本一致

《分子诊断中的“无名英雄”:蛋白酶K》

ABclonal蛋白酶K和竞品的核酸提取效果对比,在核酸提取过程中分别使用ABclonal 和竞品的蛋白酶K,ABclonal的提取效率更高,目标基因Ct值更低

 

 

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