导读

小干扰RNA（Small Interfering RNAs，siRNA）在植物的生长发育以及免疫调控中具有重要作用。在拟南芥中，siRNA有21-nt，22-nt和24-nt三种长度类型，每种长度的siRNA具有不同的功能。其中21-nt siRNA和24-nt siRNA分别由Dicer4（DCL4）和Dicer3（DCL3）切割dsRNA而产生，分别介导靶基因的mRNA降解和DNA甲基化。22-nt siRNA被认为由Dicer 2（DCL2）切割dsRNA而产生，但是22-nt siRNA的功能并不清楚。近日，南方科技大学郭红卫教授团队在国际顶级期刊Nature上发文：Plant 22-nt siRNAs mediate translational repression and stress adaptation，揭示了植物22-nt siRNA的形成和作用机制，该成果是植物小RNA研究领域一项突破性的进展。

2015年郭红卫团队在Science上发表文章：Suppression of endogenous gene silencing by bidirectional cytoplasmic RNA decay in Arabidopsis，证明了拟南芥的EIN5和SKI2能够分别介导细胞中RNA从5′-to-3’和 3′-to-5’进行降解（RNA decay），这种降解作用能够及时的清理植株细胞中的非正常mRNA (aberrant mRNA)。在EIN5和SKI2功能缺失的突变体（ein5 ski2）中，非正常的mRNA得不到及时的清除而被加工成了siRNA，从而导致突变体中21-nt和22-nt的 siRNA的大量积累，这些siRNA对正常的mRNA进行破坏性的表达抑制，引发一系列严重的生长缺陷表型。

在此次发表的Nature文章中，作者构建了ein5 dcl4和ski dcl4两个双基因突变体。由于21-nt siRNA主要由DCL4加工而成，因此在这两个突变体中不会有21-nt siRNA的积累。sRNAs-seq分析结果证实了这一推论，ein5 dcl4和ski dcl4中21-nt siRNA并没有显著改变，而22-nt siRNA的积累却明显增加。

Abundance of 21- and 22-nt siRNAs (TPM, tags per million) from all genes, excluding miRNAs and tasiRNAs. Data are presented as means ± s.d.; n = 4

进一步对sRNA-seq数据，发现ein5 dcl4和ski dcl4中过量表达的22-nt siRNA分别来自1,182和182个蛋白编码基因，并且有111个基因在二者中都存在。另外有两个编码硝酸还原酶（nitrate reductase）的基因 NIA1和NIA2 贡献了几乎一半的22-nt siRNA。

Percentages of top-scoring 22-nt-siRNA-generating loci, ranked by 22-nt siRNA abundance in ein5-1 dcl4-2 (d) and ski2-2 dcl4-2 (e) mutants

有趣的是，虽然ein5 dcl4和ski dcl4中22-nt siRNA大量积累，但是大部分22-nt siRNA的靶基因，如NIA1和NIA2，转录水平并没有明显变化，有的甚至表达量还发生了上调。作者进一步对NIA1和NIA2的蛋白水平进行研究，发现ein5 dcl4和ski dcl4中几乎检测不到NIA1和NIA2蛋白的积累，而在野生型、ein5 dcl4 dcl2和ski dcl4 dcl2中却能检测到明显的NIA1/NIA2的积累，即使添加MG132（一种26S蛋白酶体降解途径的抑制剂）也不会改变这种趋势。这说明NIA1和NIA2的蛋白翻译在ein5 dcl4和ski dcl4中受到了抑制。作者进一步对ein5 dcl4和ski dcl4中多聚核糖体（Polysome profiling）进行了分析，结果显示ein5 dcl4和ski dcl4中多聚核糖体数量明显减少。这说明22-nt siRNA主要在翻译水平上抑制基因的表达。

NIA1/2 protein abundance in the indicated plants with (+) or without (–) treatment with 100 μM MG132 for 4 h. NR antibody recognized both NIA1 and NIA2 proteins. Heat-shock protein 90 (HSP90) was used as a control.

siRNA需要结合到AGO家族蛋白上，才能发挥基因沉默的作用，作者发现AGO1的突变能够部分回复ein5 dcl4和ski dcl4 的表型，而另外两个AGO蛋白（AGO2和AGO4）并不能产生相同的效果，这说明22-nt siRNA主要通过加载到AGO1上发挥作用。另外对AGO进行免疫共沉淀结合sRNA测序发现，在野生型中，AGO主要结合21-nt siRNA，而在ein5 dcl4和ski dcl4中，AGO1则同时结合21-nt和22-nt siRNA，其中AGO1结合的22-nt siRNA，有很大部分都来自于NIA1和NIA2.

a,b,Images of 20-day-old plants of the indicated genotypes. Scale bars, 2 cm.c,IGV of AGO1-associated 22-nt-siRNA abundance at NIA1/2. IP, immunoprecipitation.

最后，作者还发现22-nt siRNA在植株的胁迫适应过程中具有重要作用。ein5 dcl4以及ski2 dcl4中ABA信号通路或盐胁迫响应通路等多个植物胁迫响应被激活，而光合作用及细胞分裂等植物生长受到抑制。另外，在缺乏氮元素时，植株的22-nt siRNA水平明显增加，伴随着NIA1和NIA2的表达下降，植株生长缓慢。因此，作者认为，植物在逆境条件下，可能通过调控22-nt siRNA的水平以及NIA1/NIA2的表达量，控制细胞中的蛋白翻译，抑制生长，减少能量消耗，同时激活自身胁迫反应，保证自身生存。