一文读懂凋亡执行蛋白Caspase家族那些事

2019年11月1日 | 评论0 | 阅读19,295 | 点赞21

背景介绍

细胞凋亡是在生理或病理条件下，机体为更好地适应生存环境，由基因控制的细胞自主有序的死亡。在凋亡的发生过程中，Bcl-2家族蛋白起着门控开关的关键性作用（详情请点击往期推文：揭秘细胞凋亡背后的幕后黑手）。抗凋亡成员蛋白和促凋亡成员蛋白在细胞死亡信号检查点之间的平衡，决定了细胞的生存或凋亡。凋亡异常将会导致癌变或者慢性退行性疾病，所以细胞凋亡一直是备受关注的研究热点。

尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱氨酸蛋白酶在凋亡执行过程中起着至关重要的作用，而且细胞凋亡的过程实际上是Caspase被活化并发生凋亡蛋白酶的级联反应，Caspase家族蛋白存在于胞浆中，它们同源性很高，结构相似，均含有一个半胱氨酸激活位点，特异地断开天冬氨酸残基后的肽键，目前被发现的Caspases有14种，它们参与调节多种生物学过程，与细胞凋亡密切相关，此外还参与细胞的生长、分化、增殖和运动。

1、Caspases家族

哺乳动物Caspase家族蛋白根据结构和功能，可以分为三大类（图1）：

>>>>第一类：促凋亡Caspases

主要包括Caspase-2，8，9，10，3，6，7。它们以级联放大的方式对胞内蛋白进行高效切割，最终导致细胞凋亡。它们被分为两派，其中Caspase 2，8，9，10参与细胞凋亡的起始（启动者，initiators）;Caspase 3，6，7参与细胞凋亡执行（效应者，effectors）。

>>>>第二类：促炎性Caspases

主要包括Caspase-1，4，5，11，12，13。在先天性免疫应答激活期间，促炎性Caspases介导特异性细胞因子（cytokines）的成熟，如Pro-IL-1β和Pro-IL-18，形成有活性的IL-1β和IL-18；但也可能参与一种称为pyroptosis（焦亡）的细胞死亡形式。

>>>>第三类：角化细胞分化

Caspase-14参与角化细胞的分化，但不会在炎症或细胞凋亡中发挥重要作用。

图1：Caspase家族图谱。图片来源于网络

2、Caspases活化

细胞中合成的Caspases以无活性的酶原状态存在，经过活化后方能执行剪切功能。Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，Caspase分子各异，但是它们活化的过程相似。需在两个亚基的连接区的天冬氨酸位点进行切割，结果产生了由两个亚基组成的异二聚体，再由两个二聚体形成有活性的四聚体。通常N-末端的肽在活化时也被除去，但对于Caspase-9是否去除N-末端肽对活性无影响。

Caspase活化基本有两种机制，即同源活化和异源活化。发生同源活化的Caspase又称之为启动Caspase（启动者），包括Caspase-2,8,9,10。诱导凋亡后，启动者通过adaptor被募集到特定的起始活化复合体，形成同源二聚体发生构像改变，导致同源分子之间的酶切而自身活化。通常Caspase-8,10,2介导死亡受体信号通路的细胞凋亡，Fas和TNFR可分别被FasL和TNF激活，导致Caspase-8和10活化。DNA损伤可诱发PIDD的表达，然后结合到 RAIDD 和 Caspase-2 上，并激活 Caspase-2，而Caspase-9参与线粒体通路的细胞凋亡，则被募集到Cyt c/dATP/Apaf-1组成的凋亡体（Apoptosome）活化。同源活化是细胞凋亡过程中最早发生的Caspase水解活化事件，启动Caspase活化后，即开启细胞内的死亡程序，然后通过异源活化方式继续水解下游Caspase将凋亡信号级联放大，同时将死亡信号向下传递。异源活化（Hetero-activation）实际上是由一种Caspase活化另一种Caspase，是一种经典的凋亡蛋白酶的酶原活化途径。被异源活化的Caspase又称之为执行Caspase（效应者），包括Caspase-3,6,7。执行Caspase不象启动Caspase，不能被募集到或结合起始活化复合体，它们必须依赖启动Caspase才能活化。

3、凋亡执行

Caspase 3和7具有相近的底物和抑制剂特异性，它们异源活化后降解PARP，DFF-45(DNA fragmentation factor-45)，导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解。而Caspase-6的底物是lamin A（详情请点击往期推文：爆款产品-明星分子Lamin A/C重组兔单抗）和keratin 18，它们的降解导致核纤层和细胞骨架的崩解。

4、细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞死亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。

细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。

>>>>方法一：形态学检测

以显微镜观察细胞甚至是亚细胞层面的形态变化和形态学特征，而具体的显微镜技术以及其所检测的凋亡形态学特征见下图（图2）：

图2：显微镜技术及其检测的凋亡相关形态学特征。图片来源于网络

>>>>方法二：流式细胞术检测（FCM, Annexin V-PI双染色实验）

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布于细胞膜磷脂双分子层内侧，细胞处于凋亡早期时，PS发生外翻出现在细胞外侧，Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，可与PS高度亲和，因而Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡晚期和死细胞中，PI可透过细胞膜与细胞核结合。Annexin V和PI配合使用，可以将凋亡早期细胞和晚期细胞以及死细胞区分开来。

Annexin V-PI双染实验可将细胞分为四种类型（图3）

图3：Annexin V-PI双染色实验

B3象限：Annexin V阴性且PI阴性（双阴性细胞）：活细胞；
B4象限：Annexin V阳性且PI阴性：早期凋亡细胞；
B2象限：Annexin V阳性且PI阳性（双阳性细胞）：晚期凋亡细胞；
B1象限：Annexin V阴性且PI阳性：坏死细胞。

>>>>3.核酸电泳检测（DNA片段检测法）

细胞凋亡时DNA会发生片段化，形成200bp的整数倍；而坏死细胞时DNA发生无规则断裂。因而在凝胶电泳中，如果出现这种显著特征的电泳条带，就可以判断细胞发生了凋亡。

图4：DNA片段凝胶电泳

>>>>4. mRNA水平的检测

科学家们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和Bcl-xL作为抗凋亡的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。因而可以用qPCR技术（详情请点击往期推文：新款通用型qPCR mix，专治各种不服 & 新品上市–Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix）来检测Fas, Bax 和 Bcl-xL基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

>>>>5. 细胞色素C的定位检测

细胞色素C（Cytochrome C）作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合Apaf-1（Apoptotic protease activating factor-1）后启动Caspase级联反应。因而可以通过组化或荧光方法检测Cytochrome C定位来判断细胞凋亡。

>>>>6. 凋亡明星分子检测

通常以Western Blot检测凋亡通路明星蛋白，如Caspase家族蛋白，Caspase 8，Caspase 6，和Caspase 3的前体和剪接体，以及Caspase 3的底物PARP分子；又如Bcl-2家族蛋白，抑制凋亡的Bcl-2和促进凋亡的Bax，在以Western Blot检测Bcl-2和Bax的表达量后，通过Bcl-2/Bax的比值，可表征细胞凋亡的程度。

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