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中科院生化细胞所陈玲玲团队首次提出相分离促进新生成rRNA前体定向转运的模型

 

基本信息

题目:Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus
期刊:Molecular Cell
作者及单位:中科院上海生物化学与细胞生物学研究所的博士生姚润文与博士生许光为共同第一作者,陈玲玲研究员为本研究论文的通讯作者
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2019年9月17日,中科院上海生物化学与细胞生物学研究所陈玲玲团队在Molecular Cell杂志上发表了题为“Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus”的文章,系统解析了人类核仁的超微三维结构以及rDNA的排布,首次提出了相分离(phase separation)促进新生成rRNA前体定向转运的模型,并发现了rRNA前体定向转运过程可以促进核仁DFC的组装。

《中科院生化细胞所陈玲玲团队首次提出相分离促进新生成rRNA前体定向转运的模型》

核仁是细胞核内最为重要的无膜细胞核亚结构,主要承担了核糖体RNA的转录,加工以及核糖体组装的功能,并在调控细胞增殖,细胞有丝分裂,响应细胞应激反应中起着重要的作用。基于电子显微镜的观察,核仁中含有FC,DFC以及GC三个独立的核仁亚区域,并认为核仁的层级结构是核糖体RNA转录与加工高度偶联的结果。然而由于核仁致密的结构以及高电子密度的特性,核仁亚区域的精细结构,核糖体RNA的转录位置以及核糖体RNA被转录后如何进入DFC区域进行后续的加工尚不清楚。

本研究中,研究者首先利用结构照明显微技术(structured illumination microscopy,SIM)在多种人类细胞中观察到了更加清晰和更多细节的核仁结构:人类核仁包含镶嵌于GC当中的数十到上百个由DFC围绕FC构成的FC/DFC转录单元,用于转录产生并加工rRNA前体(图1A)。之前研究发现,细胞核内存在活跃的核仁组织区与非活跃的核仁组织区,核仁只围绕活跃核仁组织区形成并产生rRNA (McStay and Grummt, 2008)。而研究人员利用SIM发现,活跃核仁组织区中实际包含了活跃转录的rDNA与非活跃的rDNA,FC/DFC转录中心只会在活跃rDNA上形成,并且观察到活跃的rDNA主要存在于FC与DFC的交界处,该观察与Pol I聚集于FC边缘处相吻合。通过随机光学重建显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)和生物化学定量手段,研究者确定了一个FC/DFC转录单元中含有2-3个拷贝的活跃rDNA(图1B)。进一步,研究者利用SIM,受激发射损耗荧光显微技术(stimulated emission depletion microscopy,STED)以及数学建模,首次发现了核仁DFC区域的rRNA加工因子并非均匀分布,而是规律地围绕FC聚集为18-24个簇状结构(图1C)。

《中科院生化细胞所陈玲玲团队首次提出相分离促进新生成rRNA前体定向转运的模型》

对于rRNA前体的转录位点以及rRNA前体的定位的研究,长久以来主要基于免疫电镜,难以对多个特定结构的相对定位进行细致研究。这里研究者利用单分子荧光原位杂交(Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization,smFISH)标记单个的rRNA前体分子,发现rRNA前体前414 nt主要定位在DFC区域而后续部分(498-977 nt)主要定位在FC边界区域(图2)。同一条分子具有不同的空间定位,这一现象说明rRNA前体在转录时,其前414nt部分会快速进入DFC区域,而后续部分依然在FC边界处继续转录,这是一个快速的空间转运过程(sorting),直接解释了长久以来基于电镜的研究对rRNA前体的转录位点以及rRNA前体的定位的争议。研究者针对这一现象,进行了对调控这一过程的因子的筛选,发现了核仁蛋白Fibrillarin(FBL)在这一过程中起到了关键性的作用,并且FBL的GAR与MD两个结构域对rRNA前体的加工都是至关重要的。MD是具有RNA结合位点的结构域,会直接影响rRNA前体的加工过程不难理解,但是为何具有IDR的GAR也具有促进加工的功能呢?

《中科院生化细胞所陈玲玲团队首次提出相分离促进新生成rRNA前体定向转运的模型》

接下来,研究者将视野投向了相分离。研究者首先利用体外相分离技术,成功观察到了rRNA前体的1-414nt部分可以迅速进入FBL相分离液滴内,并且这种分选过程是依赖于这段rRNA前体的高级结构,其中,rRNA中由第38-166nt形成的茎环结构尤为重要(图3A, 3B)。深入研究发现, GAR结构域中的IDR越长,FBL的自相关特性越强,对rRNA前体的分选能力也越强(图3C)。接下来,研究者在细胞内同样证实了GAR结构域中IDR的长度与FBL的自相关能力直接关联,并影响了rRNA前体定向转运的过程(图3D)。这一对定向转运的影响也直接影响了rRNA前体的加工(图3E)。更为重要的是,通过将GAR结构域替换为完全人工合成的随机IDR序列,研究者证实了FBL对rRNA前体的定向转运以及加工的促进作用是由GAR结构域中IDR的无序特性决定,而与其序列特性或结构特性无关。

《中科院生化细胞所陈玲玲团队首次提出相分离促进新生成rRNA前体定向转运的模型》

最后,研究者设计了基于CRISPR-dRfxCas13d的蛋白-RNA结合阻碍系统,在不影响rRNA前体加工的条件下,通过阻碍FBL与rRNA前体结合来抑制FBL对rRNA的定向转运。结果发现在阻碍了rRNA前体定向转运过程之后,DFC区域从球壳状结构坍塌为了实心的球状结构(图4),证实了rRNA前体的定向转运过程可以促进核仁DFC区域的组装。

《中科院生化细胞所陈玲玲团队首次提出相分离促进新生成rRNA前体定向转运的模型》

由于实验手段的局限性,长久以来,人类活细胞核仁精细结构不甚清楚,rRNA转录发生位置以及rRNA前体定位也模棱两可。该研究细化了人类核仁亚显微结构的模型,首次观察到了活跃NORs内的处于活跃与非活跃状态的两种rDNA,发现了DFC区域是非均一结构,并首次利用超高分辨率显微镜在细胞原位确定了rDNA转录位点、rRNA前体的精细定位,以及rRNA前体在FC/DFC转录单元内具有快速定向转运的特性。在细胞内,RNA是如何被正确定位到正确位置进行后续加工或发挥功能的机制鲜有研究,该研究提出由蛋白IDR介导的自相关特性可以促进相分离从而促进rRNA从其转录位点定向转运进入DFC区域进行后续加工这一概念,为RNA定位调控机制的研究提供了新的思路。除核仁外,细胞内还存在大量的无膜细胞亚结构,目前研究发现,RNA、转录以及相分离都可以促进无膜细胞亚结构的形成。该研究发现rRNA定向转运过程可以促进核仁DFC区域的组装,丰富了对无膜细胞亚结构组装机制的认识 (图5)。

《中科院生化细胞所陈玲玲团队首次提出相分离促进新生成rRNA前体定向转运的模型》

该工作中,中科院上海生物化学与细胞生物学研究所的博士生姚润文与博士生许光为共同第一作者,陈玲玲研究员为本研究论文的通讯作者。该研究受到了中科院上海营养与健康研究所杨力研究组,中科院植物生理生态研究所公共技术服务中心、国家蛋白质科学中心(上海)复合激光显微成像系统、中科院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞分析技术平台,上海科技大学免疫化学研究所影像平台,中科院深圳先进技术研究院储军副研究员,GE Healthcare Life Sciences(上海)、Leica Microsystems(上海)、Nikon instruments (上海)的大力支持。

 

参考文献

1.Boisvert, F.M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., and Lamond, A.I. (2007). The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 574-585.
2.McStay, B., and Grummt, I. (2008). The epigenetics of rRNA genes: from molecular to chromosome biology. Annu Rev Cell Dev Biol 24, 131-157.

 

陈玲玲研究员简介

2009年毕业于美国康涅狄格大学医学院获生物医学博士学位,同时获商学院工商管理学硕士学位。同年5月作为独立PI获得Connecticut Stem Cell Seed Award研究经费资助,受聘于康涅狄格大学干细胞学院从事博士后研究,并于2010年5月任助理教授。2011年1月任上海生化与细胞所研究员。目前担任国际期刊Trends in genetics、Genome biology、Journal of Biological Chemistry编委。2017年入选为霍华·德休斯医学院研究所(HHMI)国际研究员、入选国家杰出青年科学基金,获谈家桢生命科学创新奖;2016年入选全球华人生物学家协会CBIS杰出青年研究员奖、中国青年女科学家奖等荣誉。

陈玲玲研究团队长期从事环状RNA与细胞核亚结构中非编码RNA的研究。环状RNA方面,陈玲玲团队与杨力研究员团队合作,发现了两类环形RNA家族(Mol Cell, 2013)(Cell, 2014),揭示了它们全新的生成加工过程(Cell, 2014)、在基因表达调控中的作用(Cell Rep, 2016)以及与人类疾病密切的关联(Mol Cell, 2017) (Cell, 2019)。在细胞核亚结构方面,陈玲玲团队主要以核仁(Cell,2017) (Mol Cell,2019),Paraspeckles (Genes & Dev, 2015) (Nat Cell Biol, 2018),PWS小体(Mol Cell, 2012) (Mol Cell, 2016)为研究对象,深入研究了各类细胞核亚结构中非编码RNA的功能作用以及相关机制。

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