荧光定量PCR做不好？cDNA文库构建出问题？CDS总扩不出来？
想破脑壳找不出原因，万恶之源竟然很有可能是失败的逆转录（Reverse Transcription，RT）(⊙?⊙)！
是的你没看错，看似傻瓜又机械的逆转录反应，其实有很多门道，影响实验结果的因素也是方方面面。
下面列出了几点关于逆转录的Tips，可能会给你带来很大启发呦~！
Tips 1
注意逆转录酶的活性和热稳定性
逆转录酶来自RNA病毒，自然界中的逆转录酶除了能从事它的“主业”，即以RNA为模板的合成DNA外，还承担着“副业”：以DNA为模板合成DNA，以及降解RNA。我们在合成cDNA第一链时，只需要它从事“主业”，而要避免它从事“副业”。为了让逆转录酶更加“专业”，研究人员用生物技术对它做了改造，让它从事“主业”的能力更强，从事“副业”的意愿更低，使逆转录酶能更好的应用于逆转录。所以，逆转录时，一定要选择更加“专业”的逆转录酶，才能保证逆转录的效果。
逆转录酶的热稳定性同样很重要，在较高温度下进行逆转录，能够减少RNA的二级结构，增加逆转录的效率。但是野生型的M-MLV逆转录酶很“怕热”，超过37℃的温度后它的稳定性会大幅下降，因此，很多试剂盒都不会推荐在高于37℃的温度下进行逆转录。但是如果你的目的基因转录本太长，或者表达丰度太低，导致每次实验结果都不好，你不妨试一下具有更高热稳定性的逆转录酶，并在更高的温度下进行逆转录，说不定问题就解决了。
Tips 2
防止RNA模板的降解
做分子的都知道RNA很“脆弱”，一口气都能把它降解。为了保证RNA的完整性，我们经常是小心又小心，比如在冰上操作，用专门不含RNase的枪头和离心管，减少操作时间等。但是即使这样，还是经常会有意外发生，让珍贵的RNA样品在不知不觉中降解。
其实，虽然RNA“很脆弱”，但是RNase抑制剂能够为RNA提供相当安全的环境。在反应体系中，加入RNase抑制剂能有效的防止RNA降解，配合适当的操作，能够大大的降低RNA降解的风险。
Tips 3
选择合适的引物
随机引物和Oligo dT引物都能进行逆转录，但是两种方法都不完美，我们需要“扬长避短”，根据自己的实验情况进行选择合适的引物。
随机引物没有特异性，能够在整个转录本的多个位点退火，并将转录本的每一个位点都转变为cDNA。所以很适用于长转录本的5’端和具有二级结构转录本的反转录。但是随机引物能将全部的RNA（包括rRNA，tRNA，mRNA）都反转录成cDNA，而我们真正需要的mRNA只占其中的1-2%，这些rRNA和tRNA对实验造成了干扰。另外随机引物法逆转录产生的片段较小，很难得到全长转录本的cDNA，因此不太适合长的完整CDS克隆。
Oligo dT引物具有更高的特异性，只特异的与mRNA的3’端的poly（A）结合，没有rRNA和tRNA的干扰，实验稳定性更好。并且都是从转录本的3’端进行逆转录，更有可能获得完整的转录本cDNA。但是Oligo dT法也有不少缺点，比如长转录本的5’端和具有二级结构的转录本可能得不到有效的逆转录，另外，Oligo dT法对RNA的完整度和二级结构的要求较高，不适用于原核生物等。
Tips 4
用通用引物对预混液
如果你有选择恐惧症，无法判断用哪一种引物进行RT更好；或者你希望你的cDNA能有多种用途，结果可重复性更好。不用担心，有一种简单的通用方法，就是将随机引物和Oligo dT引物以一定的比例混合，配制成引物对，用这种引物对进行逆转录，就不用担心因为挑选不合适的引物而造成的实验失败了。
Tips 5
排除基因组DNA的干扰
残留的基因组DNA会对荧光定量结果造成很大的干扰，为了使结果更加的真实可重复，我们需要排除基因组DNA的干扰。一个很有用的方法是在设计qPCR引物时，将上下游引物分别设在不同的外显子上，使得cDNA和基因组DNA的扩增产物的片段长度具有明显差异。但是有时无法设计这样的引物，或者干脆你懒得这样去设计引物，其实那也没关系，你只需要在反转录的时候将基因组DNA去除干净就行了，这个时候，你就有必要选择一款具有基因组DNA去除功能的逆转录试剂盒。
Tips 6
使用一步法RT-qPCR
很多时候，提取RNA，反转录，荧光定量这一系列的实验，只是为了检测了少数基因的表达。这种情况下，不妨考虑将反转录和荧光定量合在一起做，即一步法RT-qPCR。一步RT-qPCR法可以直接以RNA为模板，进行RT-qPCR，不用额外的开管、移液操作，大大提高了检测通量和效率，并能有效防止污染。一步法RT-qPCR特别适用于诊断和快速检测。
ABclonal 逆转录相关产品
| 产品 | 描述 |
|---|---|
| RNA酶抑制剂（RK21401） | RNA酶抑制剂，不影响反转录活性 |
| ABScript II 逆转录酶（RK21400） | 高效灵活的逆转录酶单品产品 |
| ABScript II cDNA 第一链合成试剂盒（RK20400） | 包含所有cDNA第一链合成组分的成套试剂盒 |
| ABScript II逆转录预混液（RK20402） | 单管cDNA第一链合成预混液，适用于两步法RT-qPCR |
| ABScript II去基因组DNA逆转录试剂盒（RK20403） | 含有基因组DNA去除组分的cDNA第一链合成预混液，适合两步法RT-qPCR |
| ABScript II 一步法SYBR Green RT-qPCR预混液（RK20404） | 适用于一步法RT-qPCR，能单管完成cDNA合成和qPCR，主要应用于快速诊断 |
数据展示
Cat. No: RK20402 应用: RT, qPCR
样本: 293T RNA 检测基因: GAPDH, RXFP4
实验模板为293T 细胞RNA，检测基因为GAPDH和RXFP4；图中，蓝色与浅蓝色为使用ABclonal RT 及qPCR 试剂实验结果，绿色和浅绿色为使用竞品V 的RT 及qPCR 试剂实验结果；从（A）可以看到，ABclonal 产品在基因GAPDH 和RXFP4 的检测实验中，扩增效率和灵敏性更高；从（B&C）可以看到，ABclonal 产品的特异性和荧光信号更强。
Cat. No: RK20402 应用: RT, qPCR
样本: H716 RNA 检测基因: GAPDH, RXFP4
实验模板为H716 细胞RNA，检测基因为GAPDH和RXFP4；图中，蓝色与浅蓝色为使用ABclonal RT 及qPCR 试剂实验结果，绿色和浅绿色为使用竞品V 的RT 及qPCR 试剂实验结果；从（D）可以看到，ABclonal 产品在基因GAPDH 和RXFP4 的检测实验中，扩增效率和灵敏性更高；从（E&F）可以看到，ABclonal 产品的特异性和荧光信号更强。
