近年来，组织和体液中的microRNA（miRNA）已经成为一类新兴的生物标志物，有望用于疾病的诊断或监控。尤其是液体活检样本如血液或尿液等，可以通过微创或无创过程反复取样，样本容易获取，故对此类样本进行miRNA检测是特别理想的。

但是这种理想的生物标志物要想获得广泛的应用，就需要高效灵敏的检测手段。目前来说，Small RNA 高通量测序是比较理想的一种手段，它不但具有单核苷酸分辨率，可以同时分析多个样本，还能发现新的miRNA。

Small RNA测序是利用高通量技术通过二代测序平台（Illumina）对细胞或者组织中的全部Small RNA进行深度测序及定量分析等研究的测序技术。通过Illumina测序平台对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的miRNA表达图谱，实现包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs聚类和表达谱分析等科学应用；但是目前Small RNA 测序依然面临的许多挑战，例如接头二聚体的形成，测序的偏好性（接头连接偏好和PCR扩增偏好）以及低起始量样本建库成功率的问题。

 

如何构建合格的Small RNA 文库

✦ 样本问题：针对total RNA样本，最好使用完整性比较好的样本（RIN值>7），Small RNA目的文库的分析筛选只针对片段较小的样本，如果total RNA降解严重，会对后续文库构建产生影响。

ABclonal公司推出的Small RNA建库试剂盒适用模板为动植物、真菌等真核生物的total RNA，以及分离纯化的Small RNA，同时对于血浆，脑脊液，外泌体等一些特殊样本同样也可以进行Small RNA 建库。

✦ 3’Adapter连接：众所周知，3’ Adapter是一条单链DNA序列，在total RNA与3’ Adapter连接过程中，如果用常见的T4 RNA Ligase1来作为连接酶，就可能在接头连接的过程中产生RNA之间的环化连接，为此ABclonal选择了T4 RNA ligase 2，truncated 这款酶来代替T4 RNA Ligase1，T4 RNA ligase 2，truncated由于无法正常利用ATP对5′-磷酸基端进行腺化，所以只能连接预腺化的3’ Adapter和total RNA ，不会产生RNA之间的自连。

✦ 接头二聚体：在Small RNA文库构建的过程中，由于加入了3’ Adapter和5’ Adapter，投入过量的两种接头容易在T4 RNA Ligase1作用下产生自连导致接头二聚体的产生，对后续的上机测序产生影响。为了解决这一问题，ABclonal在3’ Adapter 连接后加入了RT primer，通过与3’ Adapter进行杂交从而封闭了3’ Adapter 的3’ 端，进而避免接头二聚体的产生（图1）。

ABclonal针对市场痛点，研发了一款新型Small RNA 建库试剂盒（RK20305），具有多个产品优势：

 

产品优势

1.Small RNA建库试剂盒适用于Illumina测序平台；
2.适用的模板有动植物，真菌等真核生物的total RNA以及分离纯化的Small RNA；
3.Total RNA样本起始量大于100ng；
4.通常应用分析的Small RNA种类包含miRNA，piRNA，tsRNA等；
5.接头经过优化，连接效率高，避免接头二聚体的产生。

 

Small RNA 文库展示

一般miRNA大小序列通常在20-30个nt左右，加上两端的接头序列，文库大小在150bp左右，通过6%或者10%PAGE胶可以判断Small RNA文库是否构建成功。如图所示，图2A为Rat liver total RNA 1μg 投入量，PCR 1.8X beads 纯化产物的PAGR胶图，图2B为Rat liver total RNA 1μg 投入量，PCR 1.8X beads 纯化Agilent2100 D1000 芯片分析图。

通过PAGE胶图判断文库位置后，进行割胶回收纯化，良好的文库如图3所示：

ABclonal研发的Small RNA建库试剂盒除了常规的动物组织外，同样对于植物组织样本以及人血浆样本也能够成功进行文库构建，如图4所示：

 

Small RNA 测序

在获得Small RNA文库之后，通过Illumina测序平台对Small RNA进行测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的miRNA表达图谱，实现包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs聚类等各种分析。

利用小鼠组织Total RNA构建Small RNA文库，测序数据表明Mouse 样本Small RNA 文库数据碱基分布均匀，没有GC偏好性，通过比对miRNA base，数据mapping率在60-67%之间，测序数据正常，可靠。

Table 1. Moues samples small RNA seq Data

数据比对完成之后便可以对数据进行进一步的深入挖掘了。例如Rachel Waller等[1]人研究发现，与正常人相比，患有肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ ALS）患者的脑脊液中miRNA有显著的差异表达（表2），这些miRNA调控多种神经活动，与神经元细胞缺失，脊髓神经元的神经变性和神经细胞凋亡有关。

Table 2. 差异基因表达分析

目前Small RNA 测序除了可以单独分析样品miRNA的表达差异外，更多的可以与转录组数据相结合，来了解miRNA与其靶向基因或者相关基因的调节作用。Wuqiang Ma等[2]通过对荔枝不同组织部位进行Small RNA，链特和非链特RNA测序，找到了调节荔枝生长发育相关的 miR482/2118家族和phasiRNAs，，并且发现miR482/2118家族可以介导phasiRNAs通过选择性剪切和可变聚腺苷酸化（AS/APA）与mRNA前体产生结合，这种耦合使不同外显子的PHAS基因的产生phasiRNAs，同时扩大和改变了下游phasiRNAs调控基因的范围。这一耦合现象是Small RNA介导基因沉默的新的调控机制。

 

试剂订购

ABclonal 提供的Small RNA Lib Prep Kit for Illumina试剂盒包含两个Package ：建库试剂盒和配套建库接头，使用方便，极大地解决了小RNA建库过程中接头二聚体的形成，测序的偏好性（接头连接偏好和PCR扩增偏好）以及低起始量样本建库成功率的问题。

	产品名称	产品规格
Package 1	Small RNA Lib Prep Kit for illumina（RK20305）	8RXN/24RXN/96RXN
Package 2	Small RNA Adapter Module 24 Index for Illumina（RK20354）	8RXN/24RXN/96RXN

欢迎致电400-999-6126咨询订购或者
发送邮件至cn.market@abclonal.com邮箱咨询！

 

参考文献

1. Rachel W , Matthew W , Heath P R , et al. Small RNA Sequencing of Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis Cerebrospinal Fluid Reveals Differentially Expressed miRNAs Related to Neural and Glial Activity[J]. Frontiers in Neuroscience, 2018.
2. Ma W , Chen C , Liu Y , et al. Coupling of microRNA-directed phased small interfering RNA generation from long noncoding genes with alternative splicing and alternative polyadenylation in small RNA-mediated gene silencing[J]. New Phytologist, 2017.