什么是ABclonal ?

ABclonal-第四代重组兔单抗先行者!

新品上市--Small RNA建库试剂盒

 

导读

Small RNA是RNA家族中一类非编码的RNA,其大小序列通常在20-30个nt左右,Small RNA可以通过多种途径(mRNA降解,翻译抑制,异染色质形成等)在生物体基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等过程中发挥着重要作用。随着测序技术的不断发展,人们对small RNA的研究也越来越深入。

近年来,组织和体液中的microRNA(miRNA)已经成为一类新兴的生物标志物,有望用于疾病的诊断或监控。尤其是液体活检样本如血液或尿液等,可以通过微创或无创过程反复取样,样本容易获取,故对此类样本进行miRNA检测是特别理想的。

但是这种理想的生物标志物要想获得广泛的应用,就需要高效灵敏的检测手段。目前来说,Small RNA 高通量测序是比较理想的一种手段,它不但具有单核苷酸分辨率,可以同时分析多个样本,还能发现新的miRNA。

Small RNA测序是利用高通量技术通过二代测序平台(Illumina)对细胞或者组织中的全部Small RNA进行深度测序及定量分析等研究的测序技术。通过Illumina测序平台对Small RNA大规模测序分析,可以从中获得物种全基因组水平的miRNA表达图谱,实现包括新miRNA分子的挖掘,其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs聚类和表达谱分析等科学应用;但是目前Small RNA 测序依然面临的许多挑战,例如接头二聚体的形成,测序的偏好性(接头连接偏好和PCR扩增偏好)以及低起始量样本建库成功率的问题。

 

如何构建合格的Small RNA 文库

样本问题:针对total RNA样本,最好使用完整性比较好的样本(RIN值>7),Small RNA目的文库的分析筛选只针对片段较小的样本,如果total RNA降解严重,会对后续文库构建产生影响。

ABclonal公司推出的Small RNA建库试剂盒适用模板为动植物、真菌等真核生物的total RNA,以及分离纯化的Small RNA,同时对于血浆,脑脊液,外泌体等一些特殊样本同样也可以进行Small RNA 建库。

Tip:若分析样本为血浆、血清或其余外泌体时,如果Small RNA含量比较少,在3’ Adapter连接时可以采用16℃过夜连接方法增加连接效率,避免因没有捕获到Small RNA而导致建库失败。

3’Adapter连接:众所周知,3’ Adapter是一条单链DNA序列,在total RNA与3’ Adapter连接过程中,如果用常见的T4 RNA Ligase1来作为连接酶,就可能在接头连接的过程中产生RNA之间的环化连接,为此ABclonal选择了T4 RNA ligase 2,truncated 这款酶来代替T4 RNA Ligase1,T4 RNA ligase 2,truncated由于无法正常利用ATP对5′-磷酸基端进行腺化,所以只能连接预腺化的3’ Adapter和total RNA ,不会产生RNA之间的自连。

接头二聚体:在Small RNA文库构建的过程中,由于加入了3’ Adapter和5’ Adapter,投入过量的两种接头容易在T4 RNA Ligase1作用下产生自连导致接头二聚体的产生,对后续的上机测序产生影响。为了解决这一问题,ABclonal在3’ Adapter 连接后加入了RT primer,通过与3’ Adapter进行杂交从而封闭了3’ Adapter 的3’ 端,进而避免接头二聚体的产生(图1)。

《新品上市--Small RNA建库试剂盒》

ABclonal针对市场痛点,研发了一款新型Small RNA 建库试剂盒(RK20305),具有多个产品优势:

 

产品优势

1.Small RNA建库试剂盒适用于Illumina测序平台;
2.适用的模板有动植物,真菌等真核生物的total RNA以及分离纯化的Small RNA;
3.Total RNA样本起始量大于100ng;
4.通常应用分析的Small RNA种类包含miRNA,piRNA,tsRNA等;
5.接头经过优化,连接效率高,避免接头二聚体的产生。

 

Small RNA 文库展示

一般miRNA大小序列通常在20-30个nt左右,加上两端的接头序列,文库大小在150bp左右,通过6%或者10%PAGE胶可以判断Small RNA文库是否构建成功。如图所示,图2A为Rat liver total RNA 1μg 投入量,PCR 1.8X beads 纯化产物的PAGR胶图,图2B为Rat liver total RNA 1μg 投入量,PCR 1.8X beads 纯化Agilent2100 D1000 芯片分析图。

《新品上市--Small RNA建库试剂盒》

通过PAGE胶图判断文库位置后,进行割胶回收纯化,良好的文库如图3所示:

《新品上市--Small RNA建库试剂盒》

ABclonal研发的Small RNA建库试剂盒除了常规的动物组织外,同样对于植物组织样本以及人血浆样本也能够成功进行文库构建,如图4所示:

《新品上市--Small RNA建库试剂盒》

 

Small RNA 测序

在获得Small RNA文库之后,通过Illumina测序平台对Small RNA进行测序分析,可以从中获得物种全基因组水平的miRNA表达图谱,实现包括新miRNA分子的挖掘,其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs聚类等各种分析。

利用小鼠组织Total RNA构建Small RNA文库,测序数据表明Mouse 样本Small RNA 文库数据碱基分布均匀,没有GC偏好性,通过比对miRNA base,数据mapping率在60-67%之间,测序数据正常,可靠。

Table 1. Moues samples small RNA seq Data

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数据比对完成之后便可以对数据进行进一步的深入挖掘了。例如Rachel Waller等[1]人研究发现,与正常人相比,患有肌萎缩性脊髓侧索硬化症( ALS)患者的脑脊液中miRNA有显著的差异表达(表2),这些miRNA调控多种神经活动,与神经元细胞缺失,脊髓神经元的神经变性和神经细胞凋亡有关。

Table 2. 差异基因表达分析

《新品上市--Small RNA建库试剂盒》

目前Small RNA 测序除了可以单独分析样品miRNA的表达差异外,更多的可以与转录组数据相结合,来了解miRNA与其靶向基因或者相关基因的调节作用。Wuqiang Ma等[2]通过对荔枝不同组织部位进行Small RNA,链特和非链特RNA测序,找到了调节荔枝生长发育相关的 miR482/2118家族和phasiRNAs,,并且发现miR482/2118家族可以介导phasiRNAs通过选择性剪切和可变聚腺苷酸化(AS/APA)与mRNA前体产生结合,这种耦合使不同外显子的PHAS基因的产生phasiRNAs,同时扩大和改变了下游phasiRNAs调控基因的范围。这一耦合现象是Small RNA介导基因沉默的新的调控机制。

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试剂订购

ABclonal 提供的Small RNA Lib Prep Kit for Illumina试剂盒包含两个Package :建库试剂盒和配套建库接头,使用方便,极大地解决了小RNA建库过程中接头二聚体的形成,测序的偏好性(接头连接偏好和PCR扩增偏好)以及低起始量样本建库成功率的问题。

产品名称 产品规格
Package 1 Small RNA Lib Prep Kit for illumina(RK20305) 8RXN/24RXN/96RXN
Package 2 Small RNA Adapter Module 24 Index for Illumina(RK20354) 8RXN/24RXN/96RXN

欢迎致电400-999-6126咨询订购或者
发送邮件至cn.market@abclonal.com邮箱咨询!

 

参考文献

1. Rachel W , Matthew W , Heath P R , et al. Small RNA Sequencing of Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis Cerebrospinal Fluid Reveals Differentially Expressed miRNAs Related to Neural and Glial Activity[J]. Frontiers in Neuroscience, 2018.
2. Ma W , Chen C , Liu Y , et al. Coupling of microRNA-directed phased small interfering RNA generation from long noncoding genes with alternative splicing and alternative polyadenylation in small RNA-mediated gene silencing[J]. New Phytologist, 2017.

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