什么是ABclonal ?

ABclonal-第四代重组兔单抗先行者!

新款通用型qPCR mix,专治各种不服

 

荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR),它是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对待测模板进行定量分析或对某个基因进行快速/无污染的定性检测的方法。

由于qPCR具有灵敏度高,特异性强,全封闭进行,减少操作造成的污染,自动化程度高等优势广泛用于基因表达研究领域。可以说是大多数实验汪在科研道路上需要做的实验,也是大部分实验数据的出处。

荧光定量PCR检测方法通常分为荧光染料法和探针法。染料法是一种DNA 小沟非饱和性结合染料,与DNA 结合时发光/ 不结合( 游离) 时不发光。每形成一条DNA 双链,就会有一定数量的染料结合上去,染料一旦与DNA 双链结合,就会产生荧光信号。探针法是一种水解探针(5’ Reporter, 3’ Quencher),探针完整时不发光/ 水解后发光。每形成一条DNA 双链,就会水解一条探针;每水解一条探针,就会产生一个单位荧光信号。

 

实时荧光定量PCR的优点

优点 :

★ 能够实时监控PCR 反应的进程
★ 能够精确测定每个循环的扩增片段数量,从而对样本中的起始样本量进行准确定量
★ 具有更大的检测动态范围
★ 在单管中实现扩增和检测,无需PCR 后处理。

当然,说了这么多,大家可能不以为意,一个protocol如此简单的实验有何惧哉,事实上,他矫情,事儿又多,喜怒无常,可能好多人经历过一天跑了不下6板,加样加到手抽筋,累到直不起腰,满脑子都是96孔板,要是碰上跑出来的结果ct值很高,复孔之间结果相差太大,白做了一天的实验,真是深受一万点暴击,这个世界对我太不友好了。

总结来说qPCR实验,其实和PCR差不多,只不过PCR关注的是扩增产量,而qPCR关注的起始模板数量。实验虽简单,却也马虎不得,任何细节都得注意,小编在这里给大家总结了几点容易忽视的地方:

1、熔解曲线出现多峰

引物设计不够优化:根据引物设计原则重新设计引物。
引物浓度太高:适当降低引物浓度。

2、扩增曲线形状异常

扩增曲线不光滑:信号太弱,提高模板浓度并重复实验。
个别扩增曲线骤降:反应管内有气泡,由于温度升高后气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低所致。处理样本时要注意离心,加样过程中尽量避免吸打出气泡。
扩增曲线上飘:仪器测试默认基线设置为3至15个循环荧光值的标准差,可根据实际扩增情况进行相应基线调整。

3、反应结束无扩增曲线出现

反应循环数不够:一般设置循环数为40,但需注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。
确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除引物降解的可能性。
确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
模板浓度太低:减少稀释程度并重复实验。
模板降解:重新制备模板,重复实验。
预变性时间不足:本产品采用热启动的Taq酶,请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。

4、Ct值出现太晚

扩增效率极低:优化反应条件,重新设计引物。
模板浓度太低:减少稀释程度,重复实验。
模板降解:重新制备模板,重复实验。
PCR产物太长:一般将PCR产物长度设计为70~200 bp范围内。
反应体系中存在PCR反应抑制剂:一般为加入模板时带入,加大模板稀释倍数或者重新制备新的模板。
预变性时间不足:本产品采用热启动的Taq酶,请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。

5、阴性对照(NTC)出现明显扩增

反应体系或者水被污染:更换新的Buffer或者水进行重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。
引物二聚体的出现:一般在35个循环以后阴性对照出现扩增属正常情况,可配合熔解曲线进行分析。

6、重复性差

加样体积不准:使用性能较好的移液枪,扩大反应体系,增加组分加入体积。
定量PCR仪孔间温度不一致:定期校准仪器。
模板浓度太低:模板浓度越低,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。
阈值设置:对于不同板间的重复试验,请确保两次试验仪器阈值设置保持一致。

 

ABclonal针对这些市场痛点研发了一款新型的荧光定量试剂2 X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix(RK21203),具有多个产品优势:

1、采用自主设计的特殊参比染料,分辨率更为灵敏,并且适用于市面上所有的荧光定量PCR机型,数据可靠稳定。

图1不同机型及模式下的qPCR结果
《新款通用型qPCR mix,专治各种不服》

在不同的机型和ROX模式下使用特定的“120”引物扩增大肠杆菌的gDNA:(A)无ROX模式下ABI StepOne Plus上的qPCR结果; (B)高ROX模式下ABI StepOne Plus的qPCR结果; (C)低ROX模式下ABI QuantStudio 3的qPCR结果; (D)Quantagene q225的qPCR结果。

图2不同厂家qPCR Mix产品扩增信号比较
《新款通用型qPCR mix,专治各种不服》

使用特异性“120”引物和ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix对大肠杆菌gDNA进行扩增。曲线图结果表明,ABclonal的产品具有更强,更灵敏的信号分辨率。

图3 ABclonal 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix冻融试验
《新款通用型qPCR mix,专治各种不服》

使用特异性“120”引物和ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix对大肠杆菌gDNA扩增。 曲线图结果表明,即使经过100次反复冻融, ABclonal产品仍能保持稳定扩增。

2、采用热启动Taq酶进行扩增,在保证扩增效果的同时极大地提高了产品的特异性。

图4 ABclonal qPCR Mix多物种及引物结果
《新款通用型qPCR mix,专治各种不服》

使用特异性“120”引物和ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix以及8个梯度10倍稀释模板起始量测试大肠杆菌gDNA得到的扩增曲线图(A)和熔解曲线(B); (C)对标准曲线的Ct值与相对模板量线性拟合,PCR效率达99.9%以上,线性相关系数(R2)达0.999。

3、qPCR Mix的Buffer体系经过优化,产品适用于多个物种。

图5 ABclonal qPCR Mix多物种及引物结果
《新款通用型qPCR mix,专治各种不服》

(A) 使用特异性“120”引物和ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix以及8个梯度10倍稀释模板起始量测试大肠杆菌gDNA得到的扩增曲线图; (B)使用特异性“GAPDH”,“Actin-B”和“Ywhaz”引物与ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix得到的大鼠cDNA扩增和熔解曲线图; (C)使用特异性“GAPDH”,“FARP”和“TGF”引物与ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix得到的兔cDNA的扩增和熔解曲线图。

 

>>>数据展示及竞品对比

小鼠 cDNA-GAPDH
模板投入:1.95 ng total RNA反转录产物,5个梯度10倍稀释

《新款通用型qPCR mix,专治各种不服》

 

大鼠 cDNA-ARBP
模板投入:2.2 ng total RNA反转录产物,5个梯度10倍稀释

《新款通用型qPCR mix,专治各种不服》

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