由于qPCR具有灵敏度高，特异性强，全封闭进行，减少操作造成的污染，自动化程度高等优势广泛用于基因表达研究领域。可以说是大多数实验汪在科研道路上需要做的实验，也是大部分实验数据的出处。

荧光定量PCR检测方法通常分为荧光染料法和探针法。染料法是一种DNA 小沟非饱和性结合染料，与DNA 结合时发光/ 不结合( 游离) 时不发光。每形成一条DNA 双链，就会有一定数量的染料结合上去，染料一旦与DNA 双链结合，就会产生荧光信号。探针法是一种水解探针(5’ Reporter, 3’ Quencher)，探针完整时不发光/ 水解后发光。每形成一条DNA 双链，就会水解一条探针；每水解一条探针，就会产生一个单位荧光信号。

 

实时荧光定量PCR的优点

当然，说了这么多，大家可能不以为意，一个protocol如此简单的实验有何惧哉，事实上，他矫情，事儿又多，喜怒无常，可能好多人经历过一天跑了不下6板，加样加到手抽筋，累到直不起腰，满脑子都是96孔板，要是碰上跑出来的结果ct值很高，复孔之间结果相差太大，白做了一天的实验，真是深受一万点暴击，这个世界对我太不友好了。

总结来说qPCR实验，其实和PCR差不多，只不过PCR关注的是扩增产量，而qPCR关注的起始模板数量。实验虽简单，却也马虎不得，任何细节都得注意，小编在这里给大家总结了几点容易忽视的地方：

► 1、熔解曲线出现多峰

引物设计不够优化：根据引物设计原则重新设计引物。
引物浓度太高：适当降低引物浓度。

►2、扩增曲线形状异常

扩增曲线不光滑：信号太弱，提高模板浓度并重复实验。
个别扩增曲线骤降：反应管内有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。处理样本时要注意离心，加样过程中尽量避免吸打出气泡。
扩增曲线上飘：仪器测试默认基线设置为3至15个循环荧光值的标准差，可根据实际扩增情况进行相应基线调整。

► 3、反应结束无扩增曲线出现

反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除引物降解的可能性。
确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
模板浓度太低：减少稀释程度并重复实验。
模板降解：重新制备模板，重复实验。
预变性时间不足：本产品采用热启动的Taq酶，请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。

► 4、Ct值出现太晚

扩增效率极低：优化反应条件，重新设计引物。
模板浓度太低：减少稀释程度，重复实验。
模板降解：重新制备模板，重复实验。
PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为70~200 bp范围内。
反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，加大模板稀释倍数或者重新制备新的模板。
预变性时间不足：本产品采用热启动的Taq酶，请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。

► 5、阴性对照(NTC)出现明显扩增

反应体系或者水被污染：更换新的Buffer或者水进行重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
引物二聚体的出现：一般在35个循环以后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。

► 6、重复性差

加样体积不准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体系，增加组分加入体积。
定量PCR仪孔间温度不一致：定期校准仪器。
模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
阈值设置：对于不同板间的重复试验，请确保两次试验仪器阈值设置保持一致。

 

★ 1、采用自主设计的特殊参比染料，分辨率更为灵敏，并且适用于市面上所有的荧光定量PCR机型，数据可靠稳定。

在不同的机型和ROX模式下使用特定的“120”引物扩增大肠杆菌的gDNA：（A）无ROX模式下ABI StepOne Plus上的qPCR结果; （B）高ROX模式下ABI StepOne Plus的qPCR结果; （C）低ROX模式下ABI QuantStudio 3的qPCR结果; （D）Quantagene q225的qPCR结果。

使用特异性“120”引物和ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix对大肠杆菌gDNA进行扩增。曲线图结果表明，ABclonal的产品具有更强，更灵敏的信号分辨率。

使用特异性“120”引物和ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix对大肠杆菌gDNA扩增。 曲线图结果表明，即使经过100次反复冻融， ABclonal产品仍能保持稳定扩增。

★ 2、采用热启动Taq酶进行扩增，在保证扩增效果的同时极大地提高了产品的特异性。

使用特异性“120”引物和ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix以及8个梯度10倍稀释模板起始量测试大肠杆菌gDNA得到的扩增曲线图（A）和熔解曲线（B）； （C）对标准曲线的Ct值与相对模板量线性拟合，PCR效率达99.9%以上，线性相关系数（R2）达0.999。

★ 3、qPCR Mix的Buffer体系经过优化，产品适用于多个物种。

（A） 使用特异性“120”引物和ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix以及8个梯度10倍稀释模板起始量测试大肠杆菌gDNA得到的扩增曲线图; （B）使用特异性“GAPDH”，“Actin-B”和“Ywhaz”引物与ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix得到的大鼠cDNA扩增和熔解曲线图; （C）使用特异性“GAPDH”，“FARP”和“TGF”引物与ABclonal的2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix得到的兔cDNA的扩增和熔解曲线图。

 

>>>数据展示及竞品对比

小鼠 cDNA-GAPDH
模板投入：1.95 ng total RNA反转录产物，5个梯度10倍稀释

 

大鼠 cDNA-ARBP
模板投入：2.2 ng total RNA反转录产物，5个梯度10倍稀释