什么是ABclonal ?

ABclonal-第四代重组兔单抗先行者!

WB相关注意事项及新型一步法WB 文末有大礼!

 

WB简单又复杂,
可结果往往是别家的条带是那么的perfect,
自己做的是惨不忍睹,重复到怀疑人生。
别捉急,快来get这份WB宝典吧!

制样、制胶、电泳、转膜、封闭、一抗、二抗、显影,我们一步一步慢慢道来。

首先从制样说起。制样的目的是为了获得绝大多数目的蛋白,以及合适的目的蛋白和总蛋白浓度。通常植物组织液氮研磨、动物组织匀浆器研磨、细胞直接收集即可。RIPA buffer裂解后再加loading buffer 95℃煮是一种方法,直接加入loading buffer煮样后收集也是可以的。样品过于粘稠可以用超声、延长加热时间处理。

 

tips:

曾有同学抱怨使用我们组蛋白修饰性抗体用于WB检测,信号极弱。后来得知该同学是RIPA buffer裂解细胞后离心收集上清再加入loading buffer制备样品,其实像组蛋白这类水溶性很差且与DNA结合紧密的蛋白,需要添加超声处理步骤或者直接用loading buffer收集细胞,不然损失很大哦!

直接购买预制胶的土豪可以忽略,但其他同学要记住胶要平,凝聚速度不能过快!!!

电泳时,点样顺序可得提前好好设计,空的泳道记得点上等体积的1X loading buffer。通常是恒压电泳,具体电压根据各自仪器的不同而略有差异,但不要太高哦。样品间浓度差异过大、盐浓度过高、太过粘稠、有不溶的颗粒物、胶孔不齐等是条带不过美观的主要因素,大家尽量避免啦。

接下来是转膜。在ABclonal的实验体系下,恒流(不低于200mA)转40-200min(分子量大的目的蛋白需要更更高的电流和更长的时间)能满足各种大小蛋白的实验需要。半干转虽然速度快,但效果是不如湿转的。观察预染marker、转膜后考染检测凝胶可以帮你判断转膜效果,也可以用立春红染膜判断。有同学担心蛋白穿膜,0.2μm孔径的膜是你最好的归宿!

 

tips:

tips:转膜会大量放热,注意持续保持低温;转膜槽连续使用会有大量盐在电极丝上析出,建议使用后用纯水浸泡清洗以维持正常的使用效果;细心、无气泡也是转膜的基本素质!

封闭也是必不可少的。常见的封闭剂有TBST溶解的5% 脱脂奶粉、BSA,少数抗体对某些封闭剂可能有一定背景,咨询抗体供应商选择与其一致的封闭剂吧。

一抗孵育。抗体本身的质量是WB中最最最重要的因素,这个我们单独再谈。一般选择4℃过夜孵育的效果会更好,采用5%的TBST-BSA稀释抗体是不错的选择。回收再使用别忘了叠氮化钠。

二抗孵育就不多说了。注意各种标记二抗的标记物的区别,选购时要结合效价来比较每次实验的单价,这样才能买到性价比最高的二抗,ABclonal是很好的选择。批量购买的话,一定要保证批次间无差异,ABclonal相关产品出库前可是会严格质控的。

显影底物也得提一下。市面上各种底物之间的灵敏度差异真的很大!高灵敏度的底物能很好的减少一抗的使用量。

好了,操作方法介绍到这,下面我们一起来观摩一下WB操作不当案例分析,每一个案例都是一部心酸血泪史!

 

WB操作不当案例分析

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A:封闭不完全;抗体或血清非特异结合;

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B:转膜未转完全、抗体效价过低或目的蛋白丰度过低(导致信号弱、部分信号、条带不完整),以及转膜不当造成气泡(转膜过程中,凝胶和膜没有充分贴合,出现空泡现象。检测结果中此区域的信号会较弱,影响结果判定);

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C:蛋白样本降解(蛋白样本降解后,检测到弥散或多条带);

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D:封闭液中奶粉未完全溶解;
封闭液中脱脂奶粉未完全溶解,溶液中的颗粒吸附在膜表面,颗粒占据的位置就没有封闭完全,检测结果中就会出现斑斑点点。

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E:样本上样量过大或抗体稀释度过小,检测结果中,条带连成一片。

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F:制备凝胶不均匀(在不均匀的位置,检测的条带形状会出现变形);部分信号淬灭(ECL添加不匀导致部分条带曝光时不完整)导致曝光不好;

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G:样品浓度太高;电压不稳或凝胶在电泳过程中过热,出现条带变形;

以上为一些常见的WB问题解析,是不是有似曾相识的赶脚,希望对苦苦挣扎中的你有所帮助。

说到这似乎要结束了,不急,后面还有干货。

话说WB操作好比西天取经,一路历经艰辛,仿佛不遇到点幺蛾子,就不算做过一次WB实验。吃瓜群众不禁要问,世界在进步,科学在发展,有没有简单快捷的方式,过程越多,出错的概率就越大。

 

WB一步法

常规的Western Blot检测过程(封闭,洗涤,一抗结合, 洗涤,二抗结合和洗涤)需要5-6个小时(一抗过夜需要时间更久),实验流程复杂且需要多步条件优化,使用一步法抗体可以在不减弱实验灵敏度的情况下,将封闭,洗涤,一抗结合, 洗涤,二抗结合合并为一个步骤,把实验时间锐减为2小时左右。胶上的蛋白转移到印迹膜上后,使用一抗和二抗稀释而成的抗体孵育液短时间孵育印迹膜后,经简单洗涤,即可进行发光或显色检测。

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常规WB与新型一步法WB操作示意图

除了省时省力外,新型一步法快速WB实验有检测灵敏度高和背景低等多种优点。当然这些诸多优势也不是没有限制的,自然对抗体提出了更高的需求,特异型好自不必说,且效价要高,毕竟要在短时间内发生亲和反应。

告诉你一个小秘密,ABclonal作为一家抗体服务商,每天的要电泳的SDS-PAGE胶数量超过100块,如果不是用这种省时省力的新方法,我们的抗体质控自检步骤可是完不成的哦。

 

一步法抗体结果展示

RK05658
[one step] HSP90AA1 Antibody Kit

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RK05713
[one step] TARDBP Antibody Kit

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